V súčasnosti sa ako najčastejší ochranný prostriedok proti kliešťom používajú rôzne repelenty vo forme sprejov, krémov alebo šampónov. Predložená štúdia prináša inováciu v prevencii pred napadnutím kliešťom vo forme polypropylénového vlákna s trvalou protikliešťovou úpravou PROLEN® TICKFREE s pevne ukotvenými repelentnými látkami vo vlákne, ktoré sa pomaly a dlhodobo uvoľňujú na povrch.

Úvod

Kliešte predstavujú závažný spoločensko-zdravotnícky problém. Zvyšuje sa návštevnosť prírody, a tým stúpa aj riziko kontaktu s kliešťom a možné zdravotné problémy. Proti kliešťovej encefalitíde (KE) je k dispozícii vakcína, vo vývoji je vakcína proti kliešťom ako takým, ktorá by mala zabrániť pricicaniu kliešťa, resp. aspoň tomu, aby sa nenapil krvi. Najčastejšie používaným ochranným prostriedkom proti kliešťom sú zatiaľ rôzne repelenty vo forme sprejov, krémov alebo šampónov, ale aj náramkov. Objavili sa aj ultrazvukové odpudzovače. Na trhu je ich veľké množstvo s rôznymi účinnými látkami, ich výber je vecou voľby – len na odev alebo aj na telo. Na internete sa ponúkajú aj rôzne domáce recepty z rastlín so známym repelentným účinkom.

Protikliešťové vlákna

Nová stratégia prevencie pred napadnutím kliešťom spočíva v inovácii polypropylénového (PP) vlákna s trvalou protikliešťovou úpravou PROLEN® IXO s pevne ukotvenými repelentnými látkami vo vlákne, ktoré sa pomaly uvoľňujú na povrch a znesú aj opakované pranie. Projekt spája nové prístupy v parazitológii s chemickými technológiami pre ochranu ľudí a domácich zvierat pred kliešťami a nebezpečnými chorobami, ktoré na nich prenášajú. Aditivácia PP v hmote navyše nevyžaduje pojivá, moriace a farbiace kúpele, ktoré sú zdrojom znečistenia.

Súčasťou inovácie výskumu bolo upustenie od používania syntetických pyretroidov (permetrín, deltametrín) v prospech látok menej zaťažujúcich ekosystémy a životné prostredie nielen počas používania, ale aj počas výroby. Hlavnou výhradou proti pyretroidom, ktoré sú označované ako „repelentné pesticídy“, je ich absencia selektivity (1), sú značne toxické pre všetky článkonožce vrátane opeľovačov (včely) a sú tiež vysoko toxické pre vodné organizmy (2).

Efektívnosť pri zbere kliešťov z vegetácie pre ekologické alebo epidemiologické štúdie metódou „vlajkovania“ (ťahaním flanelovej látky 1 × 1 m na rúčke ako vlajky) záleží od materiálu látky – či je to tkanina, alebo pletenina a aký má povrch. Najlepšie sú bavlnené látky ako napr. flanel alebo prací kord, kde sa kliešť dobre uchytí a vďaka rôznym tŕňom a chĺpkom na nohách sa na jemne chlpatom povrchu udrží a pri manipulácii s vlajkou neodpadne. Pre oblečenie sú zase najlepšie hladké látky, aby sa náhodne zachytený kliešť na nich naopak neudržal a čím skôr odpadol.

Človeka napáda takmer výlučne len kliešť obyčajný, a to jeho samička a druhé vývinové štádium – nymfa. Rôzne štúdie pacientov s lymskou boreliózou, ktorá patrí v súčasnosti k najrozšírenejším kliešťami prenášaným chorobám na severnej pologuli, uvádzajú, že pacienti najčastejšie opisovali pricicaného „malého čierneho“ kliešťa, teda nymfu, v niektorých štúdiách až 80 %, menej samičky. Pri zbere kliešťov v prírode je na jar viac číhajúcich samičiek, v jeseni najmä nymfy. Záleží teda aj od ročného obdobia. Len výnimočne je dokladovaný aj iný druh kliešťa, resp. sa predpokladá aj napadnutie larvou kliešťa obyčajného, ktoré však unikajú našej pozornosti.

Vedecký zámer

Prvou úlohou bolo nájsť optimálnu štruktúru (geometriu) PP tkaniny alebo pleteniny prirodzene „neatraktívnej“ pre dva najvýznamnejšie kliešte strednej Európy: kliešťa obyčajného (Ixodes ricinus) a pijaka lužného (Dermacentor reticulatus). Ak sa takáto látka skombinuje ešte s repelentom, dá sa očakávať vysoko funkčná textília s repelentným účinkom.

Druhou úlohou bolo vyrobiť funkčné PP vlákno s prídavkom repelentu pevne fixovaného v hmote vlákna v rôznej koncentrácii s trvalým účinkom aj po mechanickom namáhaní a otestovať stabilitu funkčného vlákna s aditívom počas prania. Na to bolo treba vybrať vhodné repelenty s overeným účinkom. Výsledky boli prvýkrát prezentované v roku 2017 na konferencii s medzinárodnou účasťou, XVI. Fytoapiterapeutické dni, ktorá sa konala v Košiciach (3).

Ako sa testujú repelentné účinky na kliešte

Vo vedeckej literatúre, ale aj na stránkach národných referenčných laboratórií, sa stretávame s viacerými metódami testovania repelentov na kliešťoch. Mohli by sme ich rozdeliť na testy bez prítomnosti hostiteľa a s jeho priamou prítomnosťou. Prvé sa považujú za orientačné, ale dôležité. Zisťuje sa len reakcia kliešťa na chemický podnet. V tomto teste sa vylúči možný vplyv vône tela a dychu človeka a kliešť reaguje nezávisle len na testovaný podnet v danom prostredí. Tento test sme metodicky modifikovali nasledovne: test sa vykonáva v klimatizovanej komore s cirkulujúcim vzduchom a testujúci subjekt má ochranný celotelový odev a masku, ako sme to videli pri antigénových testoch na Covid-19. Teplota v miestnosti sa udržuje medzi 18 a 20 °C a relatívna vlhkosť vzduchu medzi 60 a 70 %, s priebežnou filtráciou vzduchu cez uhlíkový filter, aby sa odstránili vnútorné aj bežné vonkajšie pachy, napr. výfukové plyny, dym z komínov, vône kvitnúcich rastlín a pod. Pri teplote nad 23 °C a vlhkosti vzduchu pod 60 % už kliešte strácajú reflex napádania hostiteľa a test je nevykonateľný, kliešte „nespolupracujú“.

Treba podotknúť, že zatiaľ čo pre vyhodnotenie efektivity nových repelentných chemických látok alebo ich nových formulácií – výrobkov proti komárom (Anophelinae, Culicinae) alebo plošticiam (Cimex lectularius) – existujú štandardizované technické normy, napr.: ASTM E951 94 a ASTM E939 94, v dostupnej literatúre a v legislatíve EÚ alebo v usmerneniach WHO zameraných na repelentné výrobky sa nám nepodarilo nájsť podobný technický štandard určený špecificky na vyhodnocovanie repelentnej účinnosti voči kliešťom (4, 5).

Orientačný test repelencie

Samotný orientačný test sa vykonáva tak, že sa na vodorovnú podložku položí prúžok bielej flanelovej látky 20 x 30 cm s naneseným repelentom o známej koncentrácii a množstve, resp. sa použije prúžok priamo testovanej textílie s inkorporovaným repelentom. Na tento prúžok sa zo skúmavky vyloží 5 živých kliešťov jedného druhu a vývinového štádia, počká sa niekoľko sekúnd, kým sa všetky kliešte dajú do pohybu a následne sa látka vyvesí za užší okraj do zvislej polohy a spustí sa časomiera. Počítajú sa sekundy odpadávania kliešťov z látky, najviac však 5 minút (300 sekúnd). Tento test sa vykoná minimálne 6-krát, vždy s inými piatimi kliešťami, ktoré neboli použité v teste s repelentom, ale mohli byť použité v negatívnej kontrole s rovnakou textíliou, ale bez repelentu. Výsledkom je priemerný čas zotrvania 30 kliešťov na vyvesenej testovanej látke bez repelentu a s repelentom a počet kliešťov, ktoré sa udržali počas 5 minút. Čím je tento čas kratší a počet zotrvaných kliešťov na látke do 5 minút menší, tým je účinnosť repelentu vyššia. Tento čas sa porovnáva aj s negatívnou kontrolou, kde sa naopak očakáva, že tento priemerný čas bude blízky 300 sekundám, okrem prípadov, kde už testujeme samotnú neatraktívnu textíliu.

Ak je priemerný čas zotrvania 30 kliešťov na vyvesenej látke menší ako 30 sekúnd, repelent sa považuje za veľmi účinný, od 30 do 100 s za účinný, pri 101 – 200 s za málo účinný a nad 200 s za neúčinný. Hodnotenie kliešťov zotrvaných na vyvesenej látke do 5 minút sa hodnotí opatrne, keďže sa stáva, že kliešť sa pri lezení po látke zamotá do jemných chĺpkov a neodpadne. V tomto prípade sa posudzuje jeho správanie, či je v číhacej polohe, t. j. či máva prednými nohami, alebo ostal bez pohybu na jednom mieste, čo je tiež prejav repelencie, takzvaný knockout efekt. Tento test sa vykonáva zvlášť so samičkami a zvlášť s nymfami Ixodes ricinus a len s dospelými kliešťami rodu Dermacentor (pijak).

Test „šikmej ruky“

Test s prítomnosťou osoby sa vykonáva v rovnako klimatizovaných podmienkach ako orientačný, osoba je bežne civilne oblečená a bez masky. Test sa vykonáva na šikmej ruke. Osoba položí ruku dlaňou na podložku a drží ju pod uhlom asi 60 stupňov s vyhrnutým rukávom. Na predlaktie, 5 cm nad zápästie k lakťu, sa upevní testovaná látka v tvare rukáva o dĺžke 30 cm. Na chrbtovú stranu obnaženej ruky sa vyloží jeden kliešť a sleduje sa jeho reakcia. Reflexne prejde z ruky na zápästie a pokračuje smerom hore k testovanej látke. Sleduje sa jeho reakcia pri kontakte s ňou. V ideálnom prípade na ňu vôbec nevylezie, resp. vylezie a do 30 sekúnd z nej následne odpadne, resp. dôjde ku knockout efektu (vysoká repelencia) alebo kliešť prejde celým rukávom a pokračuje na ramene ruky smerom hore (neúčinnosť). Tento test sa vykoná s každou vzorkou s 30 kliešťami a minimálne na troch osobách. Aj tento test sa vykonáva zvlášť so samičkami a nymfami kliešťa obyčajného a len s dospelými pijakmi.

Pri tomto teste sa stáva, že vyložený kliešť hneď zíde z ruky na podložku a aj po opätovnom vyložení na chrbát ruky z nej schádza. Tento kliešť sa do testu nepočíta, ale hodnotí sa ako neochota pre test, čo môže byť spôsobené nevhodným zaobchádzaním pri vyberaní zo skúmavky, prekážkou v ovzduší alebo aj neatraktivitou testovanej osoby pre konkrétneho jedinca kliešťa. Táto vlastnosť je nám dobre známa, a preto pre tieto experimenty hľadáme dobrovoľníkov, ktorí patria do skupiny vysoko atraktívnych, ktorých je približne 10 % populácie. Preto aj pri tomto teste sa najprv vykoná negatívna kontrola, test na šikmej ruke bez repelentnej látky, ale len s 10 kliešťami. Ak viac ako 5 kliešťov z ruky zíde, osoba sa do testu nezaradí.

Tolerancia kliešťov ku geometrii vlákna bez aditíva

Pletením/tkaním sa vytvára väzba, ktorá zaisťuje previazanie nití v pletenine/tkanine. Táto väzba ovplyvňuje celý rad vzhľadových aj úžitkových vlastností. Z uvedených dôvodov bol prvý test zameraný na overenie prirodzenej tolerancie vlákna rozdielnych štruktúr, farby, odtieňov, profilov, povrchových úprav, jemností PP plošných textílií bez pridaných aditív voči kliešťom, keďže poznanie správania sa kliešťov na textílii v závislosti od geometrických vlastností výrobku je určujúce pre porovnanie reakcie po pridaní aditíva (Graf č. 1). Testované boli 4 tkaniny v základnej plátnovej väzbe (č. 3, 6, 14, 15) s rôznou jemnosťou a farbou a 11 pletenín vo väzbách interlokových, jednolícnych i obojlícných, plyšových počesaných i nepočesaných.

Dospelé kliešte Ixodes ricunus a Dermacentor reticulatus tolerovali väčšinu geometrie tkanej a pletenej PP látky bez aditív, na rozdiel od nýmf (Graf č. 1). Samice kliešťa obyčajného mali pomerne vyrovnanú toleranciu na testované textílie, väčšinou v strednom (10 vzoriek) a vysokom stupni (5 vzoriek), v priemere 191,8 sekúnd zotrvania na vyvesenej látke. Textílie s netoleranciou samíc kliešťa obyčajného sme v testovaných vzorkách nezaznamenali. Najlepšie vlastnosti z hľadiska prirodzenej „odpudivosti“ na nymfy kliešťa obyčajného mali vzorky č. 1 a 9 až 15. Priemerný čas zotrvania na jednej látke bol 8,3 – 82,1 s.

Bola zistená pomerne veľká variabilita zotrvania nýmf na látke, čo svedčí o veľkej individuálnej citlivosti nýmf kliešťa obyčajného na testované PP vzorky. Niekoľko kliešťov odpadlo z textílie po zavesení po niekoľkých sekundách, niekoľko jedincov neodpadlo ani po 5 minútach. Samice kliešťa obyčajného testované textílie tolerovali stredne až vysoko.

U samíc pijaka lužného sme nezaznamenali žiadnu textíliu, ktorú by výraznejšie netolerovali. Priemerný čas zotrvania na všetkých vzorkách plošných textílií bol 234,1 s. Nebola pozorovaná žiadna zhoda tolerancie nýmf a samíc kliešťa obyčajného k testovaných látkam, čo poukazuje na rozdielnu vnímavosť rôznych vývinových štádií ku geometrii textílii, čo má vplyv na praktické použitie.

Pre výrobu PP vlákna s aditívom sú vhodné textílie, voči ktorým vykázali testované kliešte nízke až stredné tolerancie, teda vzorky č. 1, 5, 8, 9 a 13 až 15. Okrem textílií 1, 14 a 15 ide o frikčne tvarované PP vlákna s teoretickým priemerom filamentov 12 – 20 μm (počítané z jednotkovej jemnosti vzoriek 1 – 5 dtex) a rôzne pletené textílie, jednolícne aj interlockové, v súčasnosti bežne používané pre odevné aplikácie, ako sú tričká, tielka a legíny. Preto budú všetky nasledujúce vzorky aditivovaného vlákna pre dosiahnutie výraznejšieho odpudivého/repelentného účinku vyrábané ako vlákna s nízkou jednotkovou jemnosťou a jednoduchá pletenina.

Repelentný účinok textílií s aditívom na kliešte

Testy repelencie boli vykonané so samicami kliešťa obyčajného na vzorkách PP textílií so syntetickými akaricídnymi pesticídmi permetrínom a deltametrínom, vo dvoch a troch koncentračných radoch (Graf č. 2). U oboch pesticídnych repelentných aditív bol repelentný účinok veľmi výrazný. Pri permetríne bol už v koncentrácii 0,1 % priemerný čas zotrvania kliešťov na látke 26,5 s, pri 10-násobne vyššej koncentrácii (1 %) len 9,4 s. Pri deltametríne v koncentrácii 0,1 % kliešte zotrvali v priemere až 209,6 s, ale pri koncentrácii 0,3 % len 35,7 s. Tento priemerný čas zotrvania na kontrolnej PP vzorke bez aditíva bol 250 sekúnd. Vzorky so syntetickými akaricídmi sme porovnali s rovnakými PP textíliami s aditívami z prírodných rastlinných silíc s repelentným účinkom. Za použitia komerčne dostupného PP koncentrátu s obsahom 23 hmotnostných percent (hm%) oleja levandule lekárskej (Levandula angustifolia) boli zvláknené a vytvarované vzorky PP vlákna s obsahom 0,23; 0,69 a 1,15 hm% čistého oleja v PP hmote (1, 3 a 5 % koncentrácia PP koncentrátu/aditíva). Priemerný čas zotrvania kliešťov na textílií s koncentráciou levanduľového oleja 0,23 % bol 107,4 sekúnd. Pri testovaní vyšších koncentrácií sme zistili znižujúci sa odpudivý efekt, pri koncentrácii 0,69 % aj 1,15 % bol tento čas 171 s.

Ďalej boli pripravené dve vzorky vlákna s obsahom 1,0 a 1,5 hm% suchého extraktu ruže skalnej (Cistus incanus). Priemerný čas zotrvania kliešťov na textílií s nižšou koncentráciou extraktu (1 %) bol 161 sekúnd, pri koncentrácii 1,5 % sme zistili menej odpudivý efekt, priemerný čas zotrvania bol 206 s.

Vplyv prania na repelentný účinok funkčných textílií

Vzorky textílií s deltametrínom 0,2 % a 0,3 % boli opakovane 3-krát prané v automatickej práčke pri 30 °C 30 minút pracím programom „šetrné pranie“. Látka s deltametrínom s 0,2- aj 0,3-percentným aditívom si aj po treťom praní v automatickej práčke zachovala pomerne vysoký repelentný účinok (kliešte zotrvali v priemere 91 a 60 sekúnd).

Potenciálne praktické využitie

Pre odevy chrániace proti kliešťom sú vhodné typy pletenín obvykle používané pri výrobe športového oblečenia z PP vláken. Najúčinnejšie boli syntetické repelentné pesticídy zo skupiny pyretroidov permetrín a deltametrín. Tieto látky by pre svoju toxicitu mali byť podľa nariadenia EK nahradené netoxickými, produktmi tzv. zelenej chémie. To kladie veľké nároky na chemický priemysel i výskumné inštitúcie širokého odborného zamerania.

Z uvedeného dôvodu bolo experimentálne vyrobené PP vlákno s repelentným aditívom na báze organickej látky bez toxických účinkov. Vlákno dostalo označenie PROLEN® TickFREE, z ktorého bola upletená manžeta ponožiek, ktorá má zabrániť kliešťom prichyteným na spodnú časť nôh (topánky a ponožky) pokračovať v lezení a hľadaní miesta na pricicanie.

Prototyp „protikliešťových“ ponožiek (Obrázok č. 1) bol predstavený na medzinárodnej výstave Agrokomplex Nitra 2018, na ktorej bola tomuto výrobku udelená v kategórii Veda a výskum cena Zlatý kosák.

Na projekte sa podieľali aj stredoškolskí študenti Katolíckej spojenej školy sv. Mikuláša v Prešove, Miriam Feretová a Samuel Smoter, a to formou biologickej olympiády. Testovali repelentné účinky 13 éterických olejov rastlín na kliešťoch dvoch dominantných druhov na Slovensku. Oleje 6 druhov rastlín mali výraznejšie repelentné účinky než vybraný komerčný repelent, pričom zistili rozdielnu druhovú citlivosť kliešťov. S prácou nielenže postúpili na celoslovenskú súťaž Biologickej olympiády AMAVET (Asociácia pre mládež, vedu a techniku), ale aj na najväčšiu a najprestížnejšiu celosvetovú súťaž mladých vedcov Intel ISEF 2017 (International Science and Engineering Fair) v Los Angeles, Kalifornia, USA. So svojou súťažnou prácou The potential use of natural essential oils in prevention from ticks of Dermacentor and Haemaphysalis genus sa umiestnili na 2. mieste so striebornou medailou. Ako spoluriešitelia projektu sa zúčastnili aj výstavy Agrokomplex 2018, kde pred hodnotiacou komisiou spolu s kľúčovými riešiteľmi prezentovali svoj podiel na súťažnom exponáte (Obrázok č. 2).

Po overení výrobnej technológie na prototypoch PROLEN® TickFREE bolo ďalej vyvinuté vlákno PROLEN® IXO spĺňajúce všetky podmienky uvedenia na trh v EÚ, vyrábané bez použitia syntetických repelentov a pesticídov, poskytujúce ochranu proti kliešťom s použitím prírodných látok, ktoré neprinášajú riziko alergickej reakcie, chronickej toxicity a majú nulovú ekotoxicitu.

Ponožky s protikliešťovou úpravou manžety (Obrázok č. 3) sú len prvou prekážkou kliešťa na ceste od prichytenia sa na telo po jeho pricicanie. Ďalšími pripravovanými odevnými doplnkami z takéhoto materiálu sú aj šnúrky do topánok, podkolienky, štucne, návleky na predkolenie, opasky, pripájateľné goliere, manžety na rukávoch alebo šatky a čiapky. Rovnako sú uvažované aj vhodné doplnky a postroje pre domáce (psy, mačky) a hospodárske zvieratá (kone, kozy, ovce), ktoré by mali zabrániť alebo aspoň výrazne obmedziť pricicanie kliešťov na telo zvierat (Obrázok č. 4).

Uvedené výsledky s použitím prírodných aditív sú sľubné a uvedené príklady demonštrujú schodnosť ekologickej technológie aditivácie PP vláken v hmote prírodnými látkami. Uvedené prípady nižšieho repelentného účinku pri vyššej koncentrácii prírodného aditíva vo vlákne poukazujú aj na možné vedľajšie súvislosti, ktoré si vyžadujú ďalšie výskumy. Možné aplikácie sú najmä v odevnom priemysle, poľnohospodárstve, lesníctve, potravinárstve (obaly), ale aj v zdravotníctve a vo veterinárnej starostlivosti.

Predbežné výsledky projektu boli prezentované na medzinárodnej konferencii One Health 9th Tick and Tick-borne Pathogen Conference & 1st Asia Pacific Rickettsia Conference v Austrálii v roku 2017, na ktorom bola plagátová prezentácia ocenená prestížnou cenou „Most outstanding poster“ (najlepšia plagátová prezentácia).

Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV-15-0419, v rámci projektu Protikliešťová ochrana pomocou modifikovaných polypropylénových vlákien s akaricídnym účinkom (2016 – 2018), vedúcim projektu bol doc. MVDr. Branislav Peťko, DrSc., partneri Parazitologický ústav SAV, Prírodovedecká fakulta UPJŠ v Košiciach (RNDr. Viktória Majláthová, PhD. a RNDr. Igor Majláth, PhD.) a Chemosvit Fibrochem, s. r. o., vo Svite (Ing. Jaroslav Lučivjanský, CSc. a Ing. Tomáš Zatroch) ako realizátor výsledku.

---

Literatúra

1. Johnson R. M., Wen Z., Schuler M. A., Berenbaum M. R., Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. In J. Econ. Entomol. 99(4): 1046 1050 (2006)
2. Environmental Protection Agency, Permethrin Facts (Reregistration Eligibility Decision (RED) Fact Sheet) (2000). Dostupné online: https://www3.epa.gov/pesticides/chem_search/reg_actions/reregistration/fs_PC-109701_1-Jun-06.pdf
3. Peťko B., Lučivjanský J., Zatroch T., Majláthová V., Majláth I., Vargová B. Proti kliešťom s repelentnými polypropylénovými vláknami. In Zdravie zvierat, kvalita potravín a krmív 2018 [elektronický zdroj] : Zborník vedeckých príspevkov, zost. Pavel Naď; rec. Ivona Kožárová, Peter Lazar, Peter Popelka. - 1. vyd. - Košice : UVLF, 2018. - ISBN 978-80-8077-611-4. - CD-ROM, s. 60-65.
4. Usmernenie Európskej komisie CA-Dec12-Doc.6. 2. a: PRODUCT TYPE 18 – INSECTICIDES, ACARICIDES AND PRODUCTS TO CONTROL OTHER ARTHROPODS and PRODUCT TYPE 19 – REPELLENTS AND ATTRACTANTS (only concerning arthropods), Guidance to replace part of Appendices to chapter 7 (page 187 to 200) from TNsG on Product Evaluation (2012).
5. Usmernenie WHO WHO/HTM/NTD/WHOPES/2009.4: GUIDELINES FOR EFFICACY TESTING OF MOSQUITO REPELLENTS FOR HUMAN SKIN (2009).