POSTAVENIE A VÝZNAM MIKROSKOPICKEJ (BIOPSIE) A IMUNOLOGICKEJ DIAGNOSTIKY V OBLASTI GASTROENTEROLÓGIE

Article image

Mikroskopické vyšetrenie predstavuje v súčasnosti nevyhnutnú a neodmysliteľnú súčasť diagnostiky pre správnu terapiu ochorení zažívacieho traktu. V mikroskopickej analýze sú spracované a hodnotené rôzne materiály: tkanivá, stery, punktáty, odtlačky či voľné tekutiny. Pracoviská Alpha medical poskytujú komplexnú bioptickú a cytologickú diagnostiku, ktorá je v prípade potreby doplnená o vyšetrenie autoprotilátok.

Bioptická diagnostika

Bioptická diagnostika, t. j. mikroskopické vyšetrenie tkanív a orgánov, definuje „konečnú“ diagnózu. V súčasnosti však určuje aj mnohé prognostické údaje, ktoré dnes často napomáhajú v určovaní optimálnej terapie najmä nádorových ochorení. Využíva najmodernejšiu techniku a špeciálne HCH (histochemické) a IHC (imunohistochemické) farbiace metodiky. Okrem špeciálnych HCH a IHC metód sa využívajú aj imunofluorescenčné (NIF) a imunoblotové (IB) vyšetrenia špecifických protilátok, respektíve autoprotilátok prítomných v sére pacientov.

Imunohistochémia zohráva dôležitú úlohu pri diagnostike a diferenciálnej diagnostike širokého spektra ochorení. Imunohistochémia predstavuje špeciálnu laboratórnu techniku, ktorá využíva reakciu protilátok (polyklónových alebo monoklónových) s korešpondujúcimi antigénmi a ich následnou vizualizáciou priamo v tkanivovom reze. Veľké množstvo komerčne dostupných protilátok poskytuje zásadné informácie nielen pre patológa, ale aj pre klinika, lebo umožňuje prjímať imunohistochemické závery potrebné pre cielenú terapiu ochorenia. 

Imunohistochemické vyšetrenia sú dôležitou súčasťou gastrointestinálnej (GIT) patológie. Využívajú sa pri diagnostike nádorových, ako aj nenádorových lézií. Tráviaca trubica je u dospelého človeka dlhá 8 – 9 m a skladá sa z viacerých orgánov. Celkovo je histologická stavba týchto orgánov veľmi podobná, len slizničná výstelka je pre každý orgán špecifická a odráža jeho funkčné vlastnosti. To znamená, že v jednotlivých orgánoch sú odlišné typy epitelu. Väčšina ochorení tráviacej trubice postihuje práve slizničnú časť. Bunkové populácie, ktoré tvoria sliznicu v jednotlivých častiach GIT-u, majú svoje špecifické a charakteristické antigénne vlastnosti (súhrnne sa označujú ako bunkový fenotyp). Fenotyp buniek zohráva podstatnú úlohu pri imunohistochemickej diagnostike, respektíve diferenciálnej diagnostike lézií, ktoré z týchto buniek vznikajú – napríklad malígne nádory. 

Pri diagnostickom procese ordinuje imunohistochemické vyšetrenia (výber protilátok) erudovaný patológ podľa histomorfologického charakteru lézie a tiež podľa priložených klinických údajov.

V gastrointestinálnej patológii sa najčastejšie používa kombinácia protilátok, ktoré uvádzame v Tabuľke č. 1.

V nasledujúcom texte uvádzame príklady hodnotenia pozitívnej reakcie jednotlivých protilátok v niektorých nádorových léziách v rámci diagnostiky:

  1. dlaždicovo-bunkového karcinómu pažeráka: CK7- , CD20-, CK5/6+, CK10+, CK14+; takmer vo všetkých prípadoch pozitivita p63, väčšina prípadov je tiež pozitívna na p53 a p16,
  2. adenokarcinómu pažeráka: obyčajne exprimuje CK7, variabilná expresia CK20, AMACAR a slabá fokálna pozitivita CDX-2, negativita p16,
  3. adenokarcinómu žalúdka: 
    a) intestinálny typ – variabilne exprimuje CK7, CK20, CDX-2, MUC1 a MUC5AC,
    b) difúzny typ – viac ako 70 % je pozitívnych na CDX2, CK7, HepPar-1, variabilne exprimuje CK20, MUC2 a MUC5AC; tieto prípady sú negatívne na MUC1 a E-kadherín,
  4. neuroendokrinných nádorov: imunopozitivita na markery neurokrinnej diferenciácie, napríklad chromogranín A, synaptopysín a NSE.

Z uvedeného je zrejmé, že kombinácia vhodne vybraných protilátok predstavuje dôležitý nástroj pre správnu typizáciu základného nádorového ochorenia. Diagnostické markery môžu byť vo veľkom percente nádorov doplnené aj prognostickými a prediktívnymi markermi, napríklad Ki67, survivín a mismatch repair proteíny.

Spracovanie a mikroskopická analýza biologických materiálov získaných z rôznych oblastí tráviacej trubice, ale aj punkciami pečene či pankreasu prebieha bežným spôsobom. Využíva sa široká škála diagnostických základných i nadstavbových metodík.

Najmä zavedenie IHC analýz do morfologickej diagnostiky predstavuje jeden z najväčších prelomov vo vyše 150-ročnej histórii bioptickej praxe.

IHC diagnostika je postavená na princípe väzobnej reakcie medzi antigénom a značenou protilátkou a poskytuje dokonale spoľahlivý a komplexný výsledok viazaný na štruktúru vyšetrovaného tkaniva. Vyšetrenie umožňuje:

  • spoľahlivú základnú histogenickú analýzu hodnoteného tkaniva,
  • detailnú analýzu jeho zložiek, aj v prípade ich anomálnych zmien,
  • definovať typy samostatných buniek v benígnych i malígnych procesoch,
  • hodnotenie rastových vlastností (in situ stav, invazívny rast, proliferačný index), a tým priamo definovať prognózu aj terapiu nádorov,
  • podieľajú sa priamo na stanovení biomarkerov (EGFR, K a N RAS), a tým priamo určujú rozsah a predpokladaný efekt adjuvantnej terapie,
  • a využíva sa v priamom dôkaze mikrobiálnych agens H.P., CMV či hepatitických vírusov.

Z uvedeného je nutné si uvedomiť niekoľko podstatných argumentov: IHC vyšetrenie nie je simplexný test, je len jednou súčasťou komplexnej diagnostickej analýzy ktorá sa odohráva vo viacerých rovinách.

Využitie IHC metodík (nes rutinne využívame vyše 100 protilátok) predstavuje významnú a vysoko špecializovanú nadstavbu nad základnými a histochemickými vyšetreniami. Cieľom je dosiahnuť maximálnu možnú spoľahlivosť bioptického vyšetrenia. Až na výnimky, prakticky vždy je nutné vyšetrovať (na paralelných rezoch z rovnakého tkanivového bloku) sériu protilátok. V tom spočíva základná logika diferenciálnej diagnostiky. V prípade, že ide o nehomogénne typy nádorov, ale variabilné obrazy v rôznych vyšetrovaných lokalitách, je nutné vyšetrovať IHC rezy aj z viacerých blokov! Interpretácia IHC nálezov je súčasťou závažnej komplexnej diferenciálnej diagnostiky, ktorá si vyžaduje hlboké vedomosti a dlhoročnú prax špecializovaného bioptického diagnostika. 

Vytvorenie bioptickej diagnózy predstavuje komplexný a komplikovaný pracovný proces, na ktorom sa nevyhnutne podieľajú viacerí pracovníci – administratíva, príjmová a excidujúca laborantka, laboranti zhotovujúci parafínové bloky a následne základné H-E diagnostické histologické preparáty.

V tejto fáze nasleduje prvá diagnostická aktivita lekára, ktorý na základe komplexnej morfologickej analýzy stanoví ďalší pracovný postup: vyhotovenie špecializovaných rezov pre enzýmové analýzy, HCH alebo IHC farbenia či nutné molekulárne biologické vyšetrenia. Po ich kompletizácii nasleduje druhá záverečná fáza: detailnou analýzou predložených histologických preparátov – vrátane znalosti údajov z klinickej diagnostiky a pomocných vyšetrení – vytvára lekár špecialista konečnú morfologickú diagnózu, ktorá predstavuje komplikovaný analyticko-syntetický proces. 

Záverečným produktom bioptického vyšetrenia je komplexný morfologický bioptický nález, ktorý musí definovať detailný makro i mikroskopický popis vyšetrovaných vzoriek, materiálov či celých orgánov. 
Vlastný diagnostický nález musí jasne a pregnantne definovať patologický proces v súlade s WHO, AJCC a inými svetovo uznávanými normami. Musí vyjadriť prognosticky pohľad, a tým aj základnú či adjuvantnú terapiu. Bioptický nález je primárnym či potvrdzujúcim nálezom, na základe ktorého sú vykonané často mutilujúce operácie či komplexné – často mimoriadne nákladné – terapie. 

V oblasti diagnostiky chorobných procesov a v oblasti tráviaceho traktu jednoznačne dominujú endoskopické vzorky, ktorých diagnostika prebieha hore uvedeným spôsobom. Samozrejme, s odôvodneným využitím nadstavbových metodík, najmä pre dôkaz malabsorpčných procesov či HP IHC diagnostika v žalúdočnej sliznici.    

Samostatnou kapitolou sú enzymatické vyšetrenia, ktoré si vyžadujú najmä precízne organizačné zabezpečenie, keďže ide o vyšetrovanie vitálnych nefixovaných vzoriek (urgentná doprava zmrazených vzoriek). Pracoviská Alpha medical poskytujú aj túto možnosť.

Cytologická diagnostika

Techniky získania diagnostického materiálu sú takisto rôzne: punkcie, stery, odtlačky, endoskopické odbery či vyšetrenia voľných tekutín (najčastejšie ascites). Metodológia spracovania materiálu aj diagnostika sú rutinné, t. j. ako v iných oblastiach. Pri vytvorení „cytoblokov“ je v diagnostike možné využiť aj nadstavbové HCH a IHC metódy. 

Testovanie sérologických markerov (respektíve autoprotilátok)

Testovanie sérologických markerov (respektíve autoprotilátok) pri chorobách zažívacieho systému v poslednej dobe pokročilo do takých podrobností, že umožňuje diferenciálnu diagnostiku celiakie, ako aj autoimunitných zápalových ochorení čreva (inflammatory bowel disease), ako sú ulcerózna kolitída alebo Crohnova choroba (Tabuľka č. 2). Pritom sa využíva metóda nepriamej imunofluorescencie na rezoch príslušných tkanív (ezofagus, stena žalúdka alebo tenkého čreva). Ako spresňujúce vyšetrenie na jednotlivé markery sa používa test imunoblot (stripy) alebo farbenie biočipov (syntetické guľôčky s nadviazaným antigénom), ako aj test ELISA (antigén nadviazaný na mikrotitračnú doštičku). Napríklad je možné stanoviť sérologický marker pre pernicióznnu anémiu (antigénom je „intrinsic factor“) a odlíšiť ho od autoprotilátok voči iným antigénom parietálnych buniek žliazok žalúdočnej sliznice. Vyšetrením autoprotilátok (metódou NIF na rezoch, ako aj na bunkách Hep-2 technikou imunoblot alebo ELISA – viď. Tabuľka č. 3) je možné odlíšiť jednotlivé syndrómy autoimunitného poškodenia pečene (AIH, autoimmune hepatitis). AIH sa vyskytuje vo dvoch základných formách, AIH1 a AIH2, pričom typ AIH2 môže nadväzovať na hepatitídu vyvolanú vírusom C. Ďalšia forma autoimunitného poškodenia pečene súvisí s primárnym poškodením malých pečeňových žlčovodov (primárna biliárna cirhóza). Markery detegované v sére pomáhajú odlíšiť viaceré chorobné stavy pečene, žalúdka a čriev, čo je výhodné najmä preto, že získanie vzorky séra je pre pacienta jednoduchší postup ako odber bioptickej vzorky. Preto je vhodné, ak vyšetrenie séra predchádza odberu biopsie.

Komentár k tabuľke č. 2: V diferenciálnej diagnostike autoimunitných zápalových ochorení čreva, ako sú ulcerózna kolitída a Crohnova choroba, hrajú dôležitú úlohu protilátky proti cytoplazmovým granulám neutrofilov (antineutrophil cytoplasm antibodies, pANCA, perinukleárny obraz) alebo proti manánu vonkajšej steny kvasiniek (anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies ASCA). Pri UC sa okrem toho vyskytujú protilátky proti pohárikovým bunkám epitelu klkov čreva (AGA, anti-goblet cell Ab). Najnovšie sa pri Crohnovej chorobe zistili aj protilátky voči antigénom steny gramnegatívnych baktérií (Pseudomonas) ako napr. I2, OmpC (outer membrane porin C) alebo flagelín. Protilátky proti endomýziu (AEma) pri celiakii reagujú v teste nepriamej IF so škálou antigénov väziva v rezoch stenou ezofágu, žalúdka alebo v pečeni (väzivo v lamina propria mucosae, priestor medzi trámcami hepatocytov). Obvykle sú prítomné aj protilátky proti retikulínu (ARA), čo vo fluorescenčnom obraze dáva tkanivu sliznice vzhľad pripomínajúci plást medu. Súprava ELISA dokazuje protilátky voči transglutamináze 2, ktorá je základným antigénom prítomným v extrakte pripraveným z endomýzia (tkanivová transglutamináza, tTGA). TGA sa podieľa na metabolizme gliadínu, jedného z produktov lepku (glutén), ktorý je považovaný za základný alergén vedúci k poškodeniu epitelu tenkého čreva. Test fluorescencie na biočipoch (Euroimmun, GAF-3X) deteguje dôležitú protilátku, ktorá reaguje s gliadínom (AGA, anti-gliadin antibody).

 

Komentár k Tabuľke č. 3: Vyšetrenie autoprotilátok (metódou nepriamej IF alebo technikou imunoblot) predstavuje detekciu markerov pre rozlíšenie foriem imunitného poškodenia pečene. Protilátky AMA (anti-mitochondrial antibody) sú viditeľné v cytoplazme buniek Hep-2, ako aj pečeňových buniek; bývajú prítomné pri vrodenej (primárnej) biliárnej cirhóze (PBC, primary biliar cirrhosis). Mitochondrie obsahujú mnoho antigénov (najmenej sedem odlišných proteínových komplexov: anti-M1, M3, M4, M5, M6 až M7). Antigén M9 sa považuje za marker skorej fázy PBC (test ELISA). Ak jadrá Hep-2 buniek vykazujú fluorescenciu v podobe početných bodiek, ide o protilátky k antigénu Sp100 (soluble protein 100 kDa), ktoré charakterizujú primárnu biliárnu cirhózu. Autoimunintá hepatitída (AIH) typu 1 sa vyznačuje protilátkami ASMA, ktoré sú namierené aj proti hladkému svalu (obsahuje aktín). AIH typu 2 môže byť (okrem iného) vyvolané vírusom hepatitídy C (HC). Vyznačuje sa prítomnosťou protilátok k tzv. mikrozómovému antigénu LKM (liver-kidney microsomes, zložky LKM1, LKM2 a LKM3), ktoré sú súčasťou endoplazmového retikula. Pri AIH2 vyvolanej vírusom HC sa vyskytujú autoprotilátky voči membránovému antigénu LM (liver membrane), respektíve voči cytoplazmovému antigénu LC1 (liver cytoplasm). Okrem toho sa zisťujú autoprotilátky k antigénom SLA (soluble liver antigen) a LP (liver-pancreas), ktoré sa kedysi považovali za markery tzv. tretej formy AIH (AIH typ 3). Autoprotilátky proti asialoglykoproteínovému receptoru (ASGP-R) sa vyskytujú pri všetkých formách AIH, najmä pri relapsoch, a preto sa odporúča monitorovať liečbu pomocou príslušného testu ELISA.

Molekulárno-genetické vyšetrenia

Sú to najmodernejšie vyšetrenia tkanív slúžiace na spresnenie mikroskopickej diagnózy a určenie najmä cielenej špecializovanej liečby vybraných nádorov. Implementácia moderných metód molekulárnej biológie do histopatologickej diagnostickej praxe umožnila vznik nového odvetvia patológie – molekulárnej patológie. Molekulárna patológia sa zaoberá štúdiom procesov súvisiacich so vznikom a rozvojom chorôb na úrovni nukleových kyselín, bielkovín a iných molekúl. Predstavuje významný článok v komplexe personalizovanej medicíny a stala sa integrálnou súčasťou modernej bioptickej diagnostiky. V dobe genomickej medicíny pomáha molekulárna patológia detekciou špecifických génových zmien zvoliť čo najefektívnejšiu cielenú individuálnu terapiu. Úlohou patológa tak nie je len stanoviť presnú diagnózu, ale aj prispieť k predikcii výskytu a prognózy ochorení a poskytnúť informácie pre voľbu optimálneho klinického manažmentu.

V oblasti chorôb gastrointestinálneho traktu vystupuje do popredia problematika kolorektálneho karcinómu. Aj na Slovensku pozorujeme v súlade s celosvetovým trendom stúpajúcu incidenciu a mortalitu tejto malignity. Približne u štvrtiny pacientov možno už v čase potvrdenia diagnózy zistiť vzdialené metastázy a u okolo polovice z nich dochádza neskôr ku generalizácii nádorového procesu. Pacienti s metastatickým kolorektálnym karcinómom vkladajú nádej do biologickej liečby monoklonálnymi protilátkami (napríklad cetuximab, panitumumab). Tieto protilátky blokujú extracelulárnu doménu receptora epidermálneho rastového faktoru (EGFR), ktorý je zodpovedný za prenos signálov z EGFR do jadra s následným efektom na proliferáciu, apoptózu, angiogenézu a metastatický potenciál nádorových buniek. Jednu zo signálnych dráh predstavuje kaskáda RAS-RAF-MAPK. Predpokladom eliminácie prenosu signálu je okrem iného nemutovaný stav článkov uvedenej kaskády, inak je blokovanie receptora neúčinné a pacient sa stáva rezistentným na anti-EGFR terapiu. 

Rutinne vykonávame mutačnú analýzu onkogénov rodiny RAS (KRAS, NRAS). Približne 40 % pacientov s karcinómom hrubého čreva má mutovaný gén KRAS a u menej ako 10 % ďalších možno dokázať mutáciu v géne NRAS. U týchto pacientov je predpoklad rezistencie na anti-EGFR monoklonálne protilátky. Význam vyšetrenia spočíva nielen v indikácii anti-EGFR liečby, ale aj v prevencii negatívnych účinkov tejto terapie pre pacienta, ak by mala byť podaná neúčelne.

Mutačnú analýzu KRAS a NRAS vykonávame spravidla z parafínových blokov resekovaného nádorového tkaniva alebo z endoskopických vzoriek. Pri vyšetrení KRAS požívame metódu na princípe Melting Curve Analysis zachytávajúcu mutácie v exónoch 2, 3 a 4. NRAS analyzujeme pri nemutovanom géne KRAS metódou kvantitatívnej PCR a vyšetrujeme špecifické pozície v exónoch 2, 3 a 4. 

Záver

Naše pracoviská patológie – Alpha medical patológia, Patológia, HIS – DG, Histopatologia – sú laboratórnymi pracoviskami. Poskytujú komplexný obraz o stave pacienta prostredníctvom biopsie, cytológie, elektrónmikroskopických a imunohistochemických vyšetrení, molekulárnej patológie a iných špeciálnych vyšetrení (napr. imunofluorescenčných). Všetky výkony potrebné k zabezpečeniu týchto vyšetrení realizuje 140 odborníkov, ktorí vyhodnotia viac ako 65 tisíc bioptických a 200 tisíc cytologických vyšetrení ročne. Takýto výkon je možné dosiahnuť iba dokonalým zvládnutím všetkých potrebných procesov, od odobratia vzorky až po doručenie výsledku s permanentným monitorovaním kvality a výkonu každej etapy tohto procesu. K tomu nám pomáha aj špičková technika – ako jediní na Slovensku disponujeme mikrovlnovým automatom Tissue-Tek Xpress x120, ktorý až 10-násobne skracuje čas spracovania bioptického materiálu a zalievacím automatom Tissue-Tec Auto-TEC Embedder. Samozrejme, diagnostika nádorových ochorení tráviaceho traktu je v súlade s požiadavkami WHO noriem či odporúčaní AJCC, čo platí aj pre plnú nadstavbu metódy IHC a v prípade objektívnej indikácie aj pre genetickú analýzu, ktorá je nevyhnutná pre komplexnú terapiu. 

Informačný list
Zákon č. 160/2013 Z.z.
Zoznam diagnóz s novým kódovaním
invitro image
Tento článok sa nachádza v čísle invitro 02/2014

Gastroenterológia a hepatológia

Prečítajte si letné číslo štvrťročníka inVitro venované gastroenterológii a hepatológii. Pred dovolenkou oceníte informácie v článku profesora Krčméryho, ktorý píše o hnačkách cestovateľov. Ďalší…

doc. MUDr. František Ondriaš, CSc.

Všetky články autora
author

doc. MUDr. Július Rajčáni, DrSc.

Všetky články autora

prof. MUDr. Marian Adamkov, CSc.

Všetky články autora

doc. MUDr. Marián Benčat, PhD.

Všetky články autora

MUDr. Peter Hlavčák, CSc.

Všetky články autora