Klinická genetika sa ako interdisciplinárny odbor vyvíja ohromujúcim tempom. S rastúcimi technickými možnosťami sa rozširuje aj zoznam známych geneticky podmienených ochorení. V Unilabs poskytuje genetickú diagnostiku multidisciplinárny tím lekárskych genetikov a laboratórnych diagnostikov, ktorí využívajú široké spektrum najmodernejších techník molekulárnej biológie, aby našim klientom ponúkli rozsiahle a spoľahlivé portfólio služieb, ktoré sa neustále vyvíja podľa najnovších trendov v odbore. Naším poslaním je naplniť prísľub personalizovanej medicíny – využívať informácie o genetickej výbave pacienta na prevenciu, diagnostiku a liečbu jeho ochorenia alebo na navrhnutie klinickej stratégie šitej na mieru.

Ľudský genóm je kompletná zbierka sekvencií deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) nachádzajúca sa v bunke človeka. Ide o polymérny reťazec zložený zo štyroch stavebných blokov (tzv. nukleotidov alebo báz): adenín (A), tymín (T), cytozín (C) a guanín (G). V haploidnom stave obsahuje približne 3,1 miliardy párov báz. DNA nesie genetické inštrukcie pre vývoj, fungovanie, rast a reprodukciu každého z nás. Väčšina týchto funkcií je vykonávaná prostredníctvom proteínov, efektorov genetického kódu. V genóme človeka sa nachádza približne 20 000 génov kódujúcich proteíny, ktoré však predstavujú ani nie 2 % celkovej DNA. Táto časť genómu sa nazýva exóm. Zvyšných ~98 % DNA obsahuje napríklad intróny (génové sekvencie, ktoré sa neprekladajú do sekvencie proteínu), regulačné prvky (napríklad enhancery génov, ktoré ovplyvňujú, koľko proteínu sa z daného génu v bunke vytvorí) a iné prvky, ktorých presné funkcie ešte nie sú celkom preskúmané.

Akákoľvek zmena v štruktúre DNA (či už v kódujúcej, alebo nekódujúcej časti) môže spôsobiť genetické ochorenie. V čase písania tohto článku je v databáze OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, omim.org) opísaných viac ako 7 000 fenotypov, pre ktoré poznáme molekulárnu príčinu. Toto číslo neustále rastie, pretože sa v medicínskych publikáciách stále popisujú nové a nové genetické ochorenia. Úlohou klinickej genetiky je tieto ochorenia rozpoznať, identifikovať ich genetické príčiny a nastaviť klinickú stratégiu vhodnú pre daného pacienta. Náročnosť spočíva v tom, že rovnaký klinický prejav môže niekedy vzniknúť mutáciou rôznych génov, zatiaľ čo mutácie toho istého génu môžu spôsobiť odlišné ochorenia u rôznych ľudí. Hoci väčšina genetických chorôb momentálne nie je liečiteľná, významný pokrok v oblasti genomiky od základov zmenil prístup k ich vyhľadávaniu, prevencii a k poradenstvu, čím sa napĺňa prísľub personalizovanej medicíny.

Medzi najdôležitejšie technické pokroky v genetike patrí zavedenie Sangerovho sekvenovania (1), ktoré umožňuje určiť presné poradie nukleotidov vo fragmente DNA, zvyčajne namnoženého pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (polymerase chain reaction, PCR). Táto metóda dokáže spoľahlivo osekvenovať približne 600 báz. Sangerovo sekvenovanie sa použilo aj pri medzinárodnom vedeckom projekte Ľudský genóm (2), najväčšom svojho druhu, ktorý trval vyše desaťročie a v roku 2001 priniesol prvý koncept referenčného genómu človeka. Porovnaním sekvencií pacienta s touto referenciou je možné identifikovať rozdiely – tzv. varianty. Pomocou predikčných softvérov (napríklad na odhad dopadu variantu na funkciu proteínu), populačných databáz (na zistenie frekvencie daného variantu v populácii) a/alebo odborných publikácií potom môžeme identifikovať patogénne genetické varianty.

Miniaturizácia a masívna paralelizácia sekvenačnej reakcie viedli k vzniku sekvenovania novej generácie (next generation sequencing, NGS), ktoré umožňuje súbežne určiť sekvenciu miliónov fragmentov DNA, čo umožňuje osekvenovať niekoľko ľudských exómov alebo celých genómov v rámci jednej analýzy. NGS prístroje ale generujú terabajty dát a každý jednotlivec nesie vo svojom genóme tisíce unikátnych variantov (3). Nie každý z týchto variantov je ale nutne patogénny a aj preto by bez ďalšej pomoci s analýzou týchto veľkých súborov dát bola genetická diagnóza príliš pomalá pre klinickú prax. Preto sa do vyhodnocovacieho kroku v posledných rokoch zahŕňa umelá inteligencia, ktorá pomáha genetikom a diagnostikom prioritizovať varianty s klinickým významom na prípadnú validáciu (4). Napriek tomu pracuje laboratórny diagnostik často s dlhým zoznamom variantov, z ktorého by mal označiť ten kauzálny, nezriedka spomedzi variantov nejasného významu (variant of unknown significance, VUS), u ktorých zatiaľ nebol popísaný vzťah s ľudskými ochoreniami. V takých prípadoch sa musí posúdiť, či daná zmena môže vysvetliť klinický fenotyp, čo je zvlášť náročné pri variantoch nachádzajúcich sa v nekódujúcich oblastiach genómu. Často treba vykonať funkčné či aspoň segregačné štúdie, ktoré sledujú, či sa daný variant vždy v rámci rodiny vyskytuje u jedincov postihnutých ochorením, čo môže slúžiť ako silný dôkaz o jeho kauzalite.

Úloha genetických ambulancií v diagnostickom procese

Niektoré genetické ochorenia sú v populácii pomerne časté a ich prejavy sú dobre charakterizované a známe (napríklad potravinové intolerancie). Iné, tzv. zriedkavé ochorenia postihujú menej ako 1 z 2 000 osôb, a preto ich nie je ľahké správne identifikovať, keďže klinický genetik sa s nimi vo svojej praxi stretáva len zriedkavo. Keďže genetické testovanie si vyžaduje značné úsilie, čas, predstavuje psychickú záťaž pre pacienta a sú s ním spojené nemalé finančné náklady, dôkladný výber vhodných pacientov je kľúčovým prvým krokom v procese genetickej diagnostiky. V tomto ohľade musí byť pacient na genetické testovanie odporúčaný lekárskym genetikom (napríklad pri podozrení na dedičné ochorenie v rodine), prípadne menej často iným špecialistom (napríklad gastroenterológom pri podozrení na potravinovú intoleranciu alebo onkológom či patológom pri potrebe diagnostiky klinicky významnej mutácie v nádore pacienta). Unilabs aktuálne prevádzkuje 6 genetických ambulancií (v Bratislave, Banskej Bystrici, Spišskej Novej Vsi, v Prešove, Košiciach a Humennom), kde pacientov vyšetruje 9 lekárskych genetikov.

Medzi najčastejšie dôvody na genetickú konzultáciu patria:

• dieťa s vrodenou vývojovou poruchou,
• partnerský pár trpiaci primárnou neplodnosťou, opakovanými potratmi, narodenie mŕtveho dieťaťa,
• plánovanie gravidity v rodinách s genetickým ochorením,
• onkologické ochorenia u pacienta v mladom veku alebo opakovaný výskyt onkologických ochorení v rodine,
• neurodegeneratívne ochorenia,
• nízky vzrast, obezita, poruchy sluchu, zraku a iné.

Viac o našich ambulanciách sa dozviete na www.unilabs.sk/kontakty/ambulancie. Okrem interných lekárskych genetikov prijímame vzorky aj od externých lekárskych genetikov a od mnohých ďalších špecialistov. Celkovo je do našich genetických laboratórií mesačne zasielaných niekoľko tisíc vzoriek na testovanie.

Úloha lekára na začiatku diagnostického procesu je kľúčová. Lekárski genetici identifikujú pacientov, ktorí môžu trpieť geneticky podmieneným ochorením, najmä na základe podrobnej analýzy klinických prejavov v kombinácii s rodinnou anamnézou a štúdiom rodokmeňa. Na základe pozorovaných charakteristík môže lekársky genetik výrazne zúžiť rozsah genetických analýz, ktoré treba u konkrétneho pacienta vykonať. V ojedinelých prípadoch má lekár pomerne presné podozrenie na príčinu ochorenia, a tak na potvrdenie diagnózy stačí preskúmať jeden alebo niekoľko konkrétnych génových oblastí. V iných prípadoch, keď fenotyp ochorenia nie je jednoznačne spojený s konkrétnou molekulárnou príčinou alebo keď daný fenotyp môže byť spôsobený mutáciami vo viacerých rôznych génoch, treba analyzovať vybrané súbory génov (tzv. panely) alebo celý exóm. Vo všeobecnosti platí, že čím viac cielená je genetická analýza, tým rýchlejšie sa dá vykonať, keďže treba „prečítať“ a interpretovať menej genetických nálezov.

Hľadanie príčiny pomocou metód molekulárnej biológie

V našich štyroch špecializovaných laboratóriách ponúkame široké portfólio genetických a cytogenetických testov. V závislosti od požadovaného vyšetrenia používame metódy molekulárnej biológie na analýzu genetickej informácie daného pacienta. Tieto testy nám umožňujú zamerať sa na oba extrémy spektra (Obrázok č. 1) – na jednej strane dokážeme zhodnotiť úplnosť genómu ako celku (analýzou karyotypu), no zároveň sa vieme „zamerať“ aj na jeden jediný nukleotid (prostredníctvom genotypovej analýzy), aby sme zistili, či práve zámena v jeho pozícii je príčinou pozorovaného fenotypu. Nakoniec odosielame výsledky späť indikujúcemu lekárovi, ktorý ich klinicky zhodnotí, vysvetlí pacientovi a navrhne ďalší postup.

Karyotyp v Spišskej Novej Vsi
Chromozómy, ich veľkosť, tvar a počet môžeme vyšetriť analýzou karyotypu. Táto metóda, ktorá je zároveň jednou z najstarších techník v genetike, je dodnes v určitých prípadoch nenahraditeľná, pretože žiadna z novších techník neposkytuje porovnateľný obraz celých chromozómov. Spočíva v kultivácii buniek z krvi alebo plodovej vody a ich stimulácii k deleniu. Bunky sa následne chemicky zastavia vo fáze metafázy, keď sú chromozómy kondenzované a zafarbia sa farbivami viažucimi DNA, čím vznikajú pruhové vzory charakteristické pre jednotlivé chromozómy. Laboratórny odborník – cytogenetik potom vzorku hodnotí pod mikroskopom a identifikuje akékoľvek odchýlky od štandardného ľudského karyotypu so 46 chromozómami. Citlivosť analýzy karyotypu začína zvyčajne pri niekoľkých megabázach a končí pri celých chromozómoch, čo umožňuje diagnostiku viacerých typov abnormalít. Napríklad aneuploídiu, spôsobenú chýbaním chromozómu alebo prítomnosťou nadbytočného chromozómu (napr. Downov syndróm), je pomocou tejto metódy možné zistiť veľmi jednoducho. Cytogenetici často vedia rozpoznať aj menšie delécie alebo inzercie na základe odchýlok od normálnych pruhových vzorov. Rovnako dobre viditeľné bývajú translokácie, teda situácie, keď sa časť jedného chromozómu odlomí a pripojí k inému alebo dôjde k výmene úsekov medzi dvoma chromozómami. Pozitívne nálezy sa často dopĺňajú inými testami (vykonávanými v ďalších našich laboratóriách), ktoré umožňujú vyššie rozlíšenie a identifikáciu miest zlomu či génov zapojených do aberácií.

Rutinné testovanie v Banskej Bystrici
Najčastejšie testy, ktoré prichádzajú do našich diagnostických laboratórií, patria do kategórie rutinných vyšetrení a vykonávajú sa v našom laboratóriu v Banskej Bystrici. V rámci nich testujeme trombofilné varianty, farmakogenetické varianty, onko-hematologické varianty a dedičné poruchy ako celiakia alebo cystická fibróza. Tieto ochorenia sú často spôsobené známymi variantmi bežne sa vyskytujúcimi v populácii a možno ich analyzovať cielenými testami, ktoré špecificky vyšetria konkrétny nukleotid v genóme – genotypovou PCR reakciou v reálnom čase (real-time PCR). Táto analýza zahŕňa amplifikáciu špecifickej oblasti DNA a detekciu množstva namnoženého produktu počas každého cyklu pomocou fluorescenčných sond. Sondy špecifické pre normálny a patogénny variant sú odlíšené rôznymi fluorescenčnými farbami (napr. zelená pre normálnu alelu a červená pre patogénnu), čo umožňuje kvantifikovať množstvo DNA prislúchajúcej každej alele. Ďalej používame metódu MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification, multiplexná amplifikácia sond závislá od ligácie), ktorá využíva páry sond rôznej veľkosti na paralelné vyšetrenie viacerých lokalít genómu. Sondy sa v prvom kroku komplementárne naviažu na cieľovú DNA len tam, kde je sekvenčná zhoda, a ak sa obe časti páru naviažu blízko pri sebe, dôjde k ich spojeniu ligáciou a následne k namnoženiu. Výsledné produkty sa rozdelia podľa dĺžky kapilárnou elektroforézou. Okrem genotypizácie sa tento test používa najmä na hodnotenie počtu kópií DNA a detekciu abnormalít v génovej dávke (napr. pri spinálnej muskulárnej atrofii), keďže množstvo MLPA produktu je úmerné počtu cieľových sekvencií vo vzorke. Ak žiadna z vyššie uvedených metód nie je pre diagnostické účely vhodná alebo dostupná, vieme tiež cieľové miesto v genóme osekvenovať priamo Sangerovým sekvenovaním, ktoré umožňuje preskúmať celú cieľovú oblasť bez predchádzajúcej znalosti patogénnych zmien.

Diagnostika zriedkavých ochorení v Bratislave
Aj keď jednotlivé zriedkavé ochorenia nie sú časté, dohromady postihujú približne 6 % populácie (~325 000 Slovákov). Hoci 80 % prípadov sa dá vysvetliť genetickou poruchou, pacienti trpiaci týmito ochoreniami často absolvujú diagnostickú odyseu, ktorá môže trvať roky a zahŕňať návštevy viacerých špecialistov, čím sa oneskoruje diagnóza aj liečba. Keď je pacient konečne odoslaný k lekárskemu genetikovi a je mu odobratá vzorka na testovanie, táto sa spracováva v našom laboratóriu v Bratislave. Hoci v niektorých prípadoch vieme vykonať cielený test (napr. MLPA alebo Sangerovo sekvenovanie), genetická diagnostika býva často zložitejšia kvôli prekrývajúcim sa fenotypom alebo z  praktických dôvodov (vykonanie niekoľkých cielených testov trvá dlhšie ako jedna rozsiahlejšia analýza), a preto je častejšie vhodné vykonať rovno širšiu analýzu genómu. SNP microarray umožňuje zistiť zmeny v počte kópií DNA (napr. delécie alebo duplikácie) naprieč celým genómom ako aj detekciu oblastí so stratou heterozygozity. Tieto zmeny sú známe pri mnohých dedičných ochoreniach, napr. tých spojených s mentálnym postihnutím alebo dysmorfnými črtami (5). Čoraz častejšie však v Bratislave na získanie finálnej diagnózy používame NGS sekvenovanie – či už panelové alebo celoexómové sekvenovanie. V závere roka 2024 sme naše prístrojové vybavenie rozšírili o vysokokapacitný sekvenátor NovaSeq 6000Dx. Tento prístroj výrazne zvýšil množstvo vzoriek, ktoré dokážeme paralelne spracovať, no interpretácia výsledkov zostáva aj naďalej výzvou. V tomto smere je absolútne kľúčový tím skúsených diagnostikov, ktorí identifikujú genetické varianty a následne tieto nálezy interpretujú. Aktívna spolupráca medzi lekárskym genetikom a diagnostikom často vedie k rýchlejšiemu stanoveniu diagnózy, najmä pri interpretácii VUS. Navyše, keďže technológia NGS má svoje limitácie a istú mieru chybovosti, musíme všetky relevantné nálezy validovať nezávislou metódou (napr. Sangerovým sekvenovaním alebo MLPA). Preto sa na výsledky NGS analýz čaká niekoľko mesiacov.

Somatické testovanie v Košiciach
Doteraz sme sa sústredili na analýzy zamerané na germinálnu genetiku, teda na identifikáciu genetických variantov prítomných vo všetkých bunkách tela pacienta. V onkológii je však len ~10 % prípadov spôsobených dedičnou predispozíciou, zatiaľ čo zvyšok vzniká v dôsledku hromadenia somatických mutácií, ktoré napokon vedú k nádorovému bujneniu. Dôležité je, že aj pri dedičnej predispozícii sú nádorové bunky vysoko dynamické a meniace sa v čase (napr. v reakcii na liečbu). Nádor preto v každom momente tvorí heterogénna populácia buniek, ktorej zastúpenie sa mení a ktorej genetické pozadie určuje aj klinické správanie nádoru. V molekulárnej onkológii a patológii je dnes bežné stanoviť definitívnu diagnózu kombináciou morfologického vyšetrenia, imunofenotypizácie a genetických testov (napr. u hematoonkologických pacientov). Navyše existujú viaceré prediktívne markery, ktoré predpovedajú odpoveď na konkrétnu liečbu, a používajú sa v klinickej praxi ešte pred zahájením liečebného režimu (napr. mutácia KRAS G12C ako marker odpovede na inhibítory KRAS alebo mutácie BRCA1/BRCA2 ako markery odpovede na inhibítory PARP). V našom laboratóriu v Košiciach používame cielené testy (napr. qPCR, MLPA alebo Sangerovo sekvenovanie) alebo NGS na detekciu germinálnych aj somatických mutácií a chromozómových prestavieb, ako sú translokácie, delécie a amplifikácie. Navyše vykonávame aj fluorescenčnú in situ hybridizáciu (FISH), ktorá pomáha diagnostikovať štrukturálne chromozómové aberácie, často sa vyskytujúce v nádorových bunkách. Tieto aberácie môžu mať dôležité terapeutické dôsledky, ako je napríklad amplifikácia HER2 pri rakovine prsníka, ktorá je markerom odpovede na anti-HER2 liečbu (6).

Výhľad do budúcnosti

Genetická diagnostika Unilabs ponúka široké portfólio riešení na identifikáciu germinálnych aj somatických zmien. Čelí však dvom hlavným výzvam, ktoré sú čiastočne prepojené. Na jednej strane je čoraz ťažšie nájsť potrebný kvalifikovaný personál, ktorý je kľúčový pre udržanie vysokej kvality aj sledovania najnovších trendov v odbore. Na druhej strane sa diagnostické testy stále sústreďujú najmä na oblasti genómu kódujúce proteíny, kde je korelácia medzi genotypom a fenotypom výrazne ľahšie interpretovateľná. Už teraz však vieme, že dokážeme poskytnúť definitívnu diagnózu nie viac ako polovici našich pacientov, a preto sa budeme musieť čoraz viac zameriavať aj na „neznáme“ oblasti genómu. V budúcnosti bude preto nevyhnutné rozšíriť naše vyšetrenia aj na ďalšie časti genómu, prípadne okrem DNA vyšetrovať aj ďalšie molekuly prítomné vo vzorke. Je zrejmé, že to prinesie zložitejší diagnostický proces, kedy bude treba analyzovať a interpretovať viac nálezov, z ktorých mnohé nebudú mať jednoznačný vzťah k fenotypu, a budú vyžadovať ďalšie validačné a prioritizačné stratégie

Literatúra

1. Sanger F et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463–5467. doi: 10.1073/pnas.74.12.5463.
2. Lander ES et al. Initial sequencing and analysis of the human genome, Nature. 2001 Feb 15;409(6822):860-921. doi: 10.1038/35057062.
3. Auton A et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 2015 Oct 1;526(7571):68-74. doi: 10.1038/nature15393.
4. Doung D et al. Artificial intelligence in clinical genetics. European Journal of Human Genetics. 2025 volume 33, pages281–288.
5. Shaw-Smith C et al. Microarray based comparative genomic hybridisation (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8. doi: 10.1136/jmg.2003.017731.
6. Ellis CM et al. HER2 amplification status in breast cancer: a comparison between immunohistochemical staining and fluorescence in situ hybridisation using manual and automated quantitative image analysis scoring techniques. J Clin Pathol. 2005 Jul;58(7):710–714. doi: 10.1136/jcp.2004.023424.