Infarkt myokardu, ischemická cievna mozgová príhoda či závažné ataky venózneho tromboembolizmu patria medzi časté príčiny úmrtí, respektíve prekonanie takejto trombotickej komplikácie často dramatickým spôsobom mení kvalitu života pacienta. Trombocyt zohráva v procese zrážania krvi dôležitú úlohu. Poznanie jeho štruktúry, funkcie, ako aj možností ovplyvnenia jednotlivých procesov, do ktorých sa aktívne, či pasívne zapája, sa v tomto svetle javí ako mimoriadne potrebné. V súčasnosti sa mnohé výskumy zameriavajú nielen na možnosti účinnej liečby, ale najmä na identifikáciu možných laboratórnych parametrov s prediktívnou hodnotou.

Trombocyt

Trombocyty, nazývané aj krvné doštičky, sú najmenšími bunkami v ľudskom tele. Sú dôležitou súčasťou krvi a ich hlavnou úlohou je (spolu s koagulačnými faktormi) reagovať na krvácanie po poškodení cievy zhlukovaním sa a iniciovaním procesu zrážania krvi. (1) Krvné doštičky sú bezjadrové bunky, predstavujú úlomky cytoplazmy megakaryocytov v kostnej dreni, ktoré sa vyplavujú do cirkulácie. Cirkulujúce neaktívne krvné doštičky majú bikonkávny diskoidný (šošovkovitý) tvar. V tomto neaktívnom stave veľkosťou nepresahujú v najväčšom rozmere 2 – 3 µm. (1) Neaktivovaný trombocyt má na svojom povrchu množstvo plytkých záhybov. Po aktivácii za účelom zväčšenia celkového povrchu trombocytu, a tým aj odhalenia potrebných receptorov, dochádza k tvorbe mnohých výbežkov – pseudopódií, ktoré sú nevyhnutné pri vytváraní primárnej zátky. Trombocyt má v aktivovanom stave tvar chobotnice. (Obrázok č. 1)

Napriek malým rozmerom má trombocyt veľmi dobre zadefinovanú štruktúru a morfológiu, ktorá je nevyhnutná pre jeho úlohu v hemostáze, ako aj v udržiavaní cievnej integrity.

Trombocyty preto obsahujú mnohé intracelulárne štruktúry, medzi ktoré patria najmä rôzne druhy granúl – denzné granuly, α-granuly, λ- a γ-granuly. Aktivované doštičky uvoľňujú obsah týchto granúl pomocou kanálikového systému do extracelulárneho priestoru. Jednoducho povedané, naviazané a aktivované trombocyty uvoľňujú chemotaktické látky za účelom pritiahnutia ďalších trombocytov na miesto endotelového poškodenia.

α-granuly (alfa) obsahujú P-selektín, doštičkový faktor 4 (platelet factor 4 – PF4), transformujúci rastový faktor β1 (transforming growth factor β1 – TGFβ1), od doštičiek odvodený rastový faktor (platelet-derived growth factor – PDGF), fibronektín, β-trombomodulín, von Willebrandov faktor (vWF), fibrinogén a koagulačné faktory V a XIII. (2)

δ-granuly (delta/denzné) obsahujú ADP alebo ATP, vápnikové ióny a serotonín. (2)

γ-granuly (gamma) sú podobné lyzozómom a obsahujú niekoľko typov hydrolytických enzýmov. (2)

λ-granuly (lambda) obsahujú peroxizómy. (2)

Funkcia trombocytov

Ako už bolo vyššie spomínané, hlavnou úlohou krvných doštičiek je zúčastňovať sa na hemostáze – procese zastavenia krvácania v mieste porušeného endotelu. V prvom kroku sa trombocyty viažu na odhalené subendotelové štruktúry. Tento jav sa nazýva adhézia. Následne dochádza k zmene tvaru krvnej doštičky, čo vedie k expozícii receptorov na jej povrchu a k sekrécii chemických zlúčenín – k aktivácii. Agregácia trombocytov v treťom kroku je charakterizovaná vytváraním spojení medzi doštičkami navzájom. Formovanie tejto doštičkovej zátky (primárna hemostáza) je spojené s aktiváciou koagulačnej kaskády, ktorej konečným produktom je vytvorenie fibrínu a pevnej fibrínovej zátky. (3)

Vyšetrenia trombocytov

Medzi základné vyšetrenia trombocytov patrí v prvom kroku vyšetrenie krvného obrazu pomocou automatického hematologického analyzátora, ďalej len krvinkový analyzátor. Medzi sledované doštičkové parametre patrí počet trombocytov (PLT), ich veľkosť (stredný objem trombocytov – MPV – medium platelet volume) a distribučná šírka trombocytov (PDW – platelet distribution width).

Počet trombocytov

Fyziologický počet trombocytov sa v kaukazskej populácii pohybuje v rozmedzí 150 – 450 × 109/l. (1) Počet trombocytov je o čosi vyšší u žien než u mužov a s určitými cyklickými zmenami – s miernym poklesom počas menštruácie. (4) Nižší počet krvných doštičiek sa fyziologicky vyskytuje v zdravej afro-karibskej populácii a u africkej rasy je celkovo nižší v porovnaní s kaukazskou rasou. (4) Znížený počet trombocytov v periférnej krvi sa nazýva trombocytopénia, zvýšený počet trombocytóza.

Zvýšený počet trombocytov môže byť reaktívneho charakteru. Trombocytózu detegujeme často v prípade akútnych stavov – pri infekčných ochoreniach, po operáciách, pri hojení rán. Miernu, no chronickú trombocytózu typicky nachádzame v teréne chronických anémií, najmä v prípade zvýšených chronických krvných strát. Po úprave anémie dochádza aj k úprave trombocytózy. Pretrvávajúca až progredujúca trombocytóza je charakteristickým znakom myeloproliferatívnych ochorení a je nevyhnutné zrealizovať diagnostické kroky za účelom ich vylúčenia.

Pri zníženom počte trombocytov rozlišujeme ľahkú, stredne ťažkú a ťažkú trombocytopéniu. V klinickej praxi sa používa viacero klasifikácií, no vo všeobecnosti možno za stredne ťažkú trombocytopéniu považovať počet trombocytov v rozmedzí 30 – 70 × 109/l, za ťažkú trombocytopéniu počet trombocytov pod 30 × 109/l. (3) Stredne ťažké až ťažké trombocytopénie vyžadujú urgentnú diferenciálnu diagnostiku, najmä za účelom rozlíšenia možnej primárnej imúnnej trombocytopénie od trombocytopénie sprevádzajúcej závažné ochorenia krvotvorby.

V klinickej praxi sa nezriedkavo stretávame aj s fenoménom pseudotrombocytopénie. Ide o stav, pri ktorom počas vyšetrenia krvného obrazu pomocou krvinkového analyzátora zachytávame falošne nízky počet trombocytov rôzne závažného stupňa. U časti populácie dochádza po odobratí periférnej krvi do skúmavky s obsahom protizrážavého roztoku kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA) k zhlukovaniu trombocytov spolu s leukocytmi do roziet. Tento jav je výsledkom väzby prirodzene sa vyskytujúcej protilátky (aglutinínu) na glykoproteín IIb/IIIa, ktorý sa exponuje po odštiepení iónov vápnika v prítomnosti EDTA. (3) Z vlastných klinických skúseností vyplynulo, že pri rýchlej analýze vzorky pacienta s podozrením na pseudotrombocytopéniu maximálne do 30 minút od odberu nedetegujeme významne znížené počty trombocytov. Po prekročení tohto limitu zvyčajne pozorujeme signifikantný pokles trombocytov až na úroveň ťažkej trombocytopénie v priamej závislosti od dĺžky časového intervalu. Táto skutočnosť vysvetľuje prípady, keď sme u toho istého pacienta v priebehu len niekoľkých dní zaznamenali diametrálne odlišné počty krvných doštičiek. Preto sa v situáciách, keď nie je možné zabezpečiť okamžitú analýzu, odporúča odber vzorky do skúmavky s obsahom protizrážavého roztoku citrátu sodného – fyziologický počet trombocytov potvrdí podozrenie na pseudotrombocytopéniu.

Stredný objem trombocytov (MPV)

Na stanovenie veľkosti trombocytov sa využívajú rovnaké techniky ako pri analýze červených krviniek. MPV sa odvodzuje z impedančnej distribučnej krivky. Za fyziologický sa považuje objem trombocytov v rozmedzí od 6,5 – 12 fl. Parameter je veľmi závislý od spôsobu analýzy a od času a spôsobu uskladnenia vzorky periférnej krvi pred samotným vyšetrením. Ak sa na vyšetrenie použije impedančná technika, MPV nepriamo úmerne koreluje s počtom trombocytov u zdravých jedincov. MPV je naopak nižší, ak je trombocytopénia dôsledkom megaloblastovej anémie alebo zlyhania kostnej drene. (4) Veľké trombocyty sú viac hemostaticky aktívne ako trombocyty menšie. Po funkčnej stránke je teda prítomnosť väčších trombocytov významnejšia ako znížený MPV. Vzostup MPV bol pozorovaný v prípade pacientov s vyšším rizikom infarktu myokardu a ischemických cievnych mozgových príhod. (4) Vysoký MPV je typickým nálezom pri vrodených makrotrombocytopéniách. Medzi najznámejšie vrodené trombocytopénie s veľkými trombocytmi patrí aj Bernardov-Soulierov syndróm (spojený aj s trombocytopatiou) či Mayova-Hegglinova anomália, Epsteinov syndróm, Fechtnerov a Sebastianov syndróm, pri ktorých je makrotrombocytopénia jedným z typických nálezov pri komplexných syndrómoch. (3) Vo všeobecnosti býva MPV zvýšený aj v teréne myeloproliferatívnych ochorení, no na odlíšenie esenciálnej trombocytémie od reaktívnych foriem je tento parameter nedostatočný. (4)

Distribučná šírka trombocytov a iné doštičkové parametre

Z ostatných parametrov, ktoré bývajú automaticky počítané a uvádzané, je vhodné spomenúť ešte distribučnú šírku trombocytov (platelet distribution width – PDW), ktorá informuje o „miere uniformnosti“ krvných doštičiek. Poukazuje na prípadnú anizocytózu v populácii trombocytov. PCT – „platokrit“ je analógiou hematokritu. Vypočítava sa na základe MPV a celkového počtu trombocytov a zodpovedá objemu cirkulujúcich trombocytov v určitom objeme krvi (1) (s fyziologickými hodnotami 1,08 – 2,82 ml/l). Niektoré analyzátory udávajú aj pomerné zastúpenie veľkých trombocytov (platelet large cell ratio – P-LCR), ktoré sú väčšie ako stanovená horná hranici 12 fl. (1) V našich podmienkach sa za fyziologické hodnoty považuje prítomnosť týchto buniek v rozmedzí 11 – 45 %.

Vysoký P-LCR alebo PDW môžu signalizovať aj periférnu deštrukciu doštičiek na imunitnom podklade. (1) PCT je parameter vypočítaný a nemá význam pre klinickú prax. (1) Všetky sledované doštičkové parametre sú špecifické pre použitý typ analyzátora, preto je nevyhnutné riadiť sa referenčnými hodnotami udávanými v danom laboratóriu. (1)

Morfologické vyšetrenie trombocytov

V krvnom nátere pri použití klasickej optickej mikroskopie sa trombocyty javia ako purpurové bodkovité útvary, ktorých priemer predstavuje približne 20 % priemeru červenej krvinky. V krvnom nátere sa hodnotí počet, tvar, veľkosť, ako aj tvorba prípadných zhlukov trombocytov (Obrázok č. 2).

Elektrónová mikroskopia sa v bežnej klinickej praxi v rutinnom vyšetrení nepoužíva, ale jej zavedenie pred viac ako 70 rokmi prinieslo zásadné poznatky o ultraštruktúre trombocytov v neaktívnom aj aktivovanom stave, čo viedlo k porozumeniu ich funkcie v procese hemostázy.

Funkčné vyšetrenie trombocytov

V poslednom období vzrástla klinická požiadavka na vyhodnotenie funkcie trombocytov. Zhodnotiť ich funkčný stav je veľmi dôležité v rámci diagnostiky krvácavých ochorení, pri hodnotení odpovede na podávanú protidoštičkovú liečbu, pri perioperačnom vyhodnocovaní hemostázy. (2) Existuje množstvo testov, no často sú založené na rôznom princípe – vyhodnocovanie agregability, aktivácie trombocytov, fyzikálnych vlastností krvnej zrazeniny, správania sa trombocytov v podmienkach rôzneho šmykového napätia... Veľkou nevýhodou pri hodnotení funkčného stavu trombocytu je skutočnosť, že krvné doštičky sú bunky, ktoré sa veľmi ľahko aktivujú počas predanalytickej fázy vyšetrenia, čím môže dochádzať aj k výraznému skresleniu získaných údajov. Prehľad najčastejšie využívaných testov funkcie trombocytov rozdelených na základe princípu vyšetrenia uvádza Tabuľka č. 1. Poruchu funkcie trombocytov označujeme termínom trombocytopatia.

Základným princípom testovania funkcie trombocytov (no aj celkového vyšetrenia trombofilného stavu) by mala byť kladná odpoveď na otázku, či bude mať výsledok testovania vplyv na ďalší manažment liečby pacienta. (5) V prípade hlbokej venóznej trombózy (HVT) sa najčastejšie odporúča testovanie pacientov po jej prekonaní najmä v mladšom veku (do 45. roku života), bez jasného vyvolávajúceho faktora, v prípade výskytu trombózy v atypickej lokalite (v. lienalis, mezenteriálne vény…) a tiež v prípade pozitívnej rodinnej anamnézy na výskyt HVT. Mnohé realizované štúdie skúmajúce vzťah medzi vrodenou trombofíliou a artériovými trombotickými komplikáciami neviedli k jednoznačným záverom. (6) Neexistujú jasné dôkazy, že by prítomnosť vrodenej trombofílie mala viesť k inej forme sekundárnej prevencie. (5, 7) Vyšetrenie trombofilného stavu (vrodeného aj získaného) sa často realizuje aj v rámci diferenciálnej diagnostiky tehotenských komplikácií. Medzi najčastejšie patria opakujúce sa straty plodu, pôrod mŕtveho plodu, preeklampsia, intrauterinná rastová retardácia plodu. V poslednom čase býva trombofilný stav vylučovaný aj po neúspešných cykloch asistovanej reprodukcie a v prípadoch primárnej alebo sekundárnej sterility pacientky, aj keď indikácia vyšetrenia za týchto okolností nie je celkom jasná. Zhodnotiť vplyv trombofílie alebo zmien iných hemostazeologických laboratórnych parametrov na výskyt vyššie uvedených tehotenských komplikácií je veľmi náročné. Potvrdenie kauzality pri prítomnosti iných, mnohokrát významnejších nehematologických faktorov je takmer nemožné. (6) Bola potvrdená najmä súvislosť s intrauterinnou rastovou retardáciou a preeklampsiou. (9) V týchto dvoch prípadoch bol potvrdený aj benefit z podávanej prevencie pomocou kyseliny acetylsalicylovej (ASA) alebo nízkomolekulových heparínov (LMWH – low molecular weight heparins). (10)

K vyšetreniu funkčného stavu trombocytov pristupujeme pri klinických ťažkostiach pacienta/pacientky a pri negatívnom výsledku základného skríningu trombofilného stavu (neprítomnosť vrodenej trombofílie, negatívne vyšetrenie na antifosfolipidový syndróm, ako aj pri fyziologickom náleze parametrov špeciálnej hemostázy). Po odobratí vzorky periférnej krvi je nevyhnutné zrealizovať vyšetrenie v čo najkratšom čase. Pri vyhodnocovaní analýzy treba mať na pamäti, že výsledok môže byť ovplyvnený viacerými nezávislými faktormi pôsobiacimi počas predanalytickej aj analytickej fázy vyšetrenia. Základným princípom je zabezpečiť odber a spracovanie vzoriek pacientov za rovnakých podmienok, aby boli výsledky vyšetrenia interpretovateľné a navzájom porovnateľné. (2) Medzi faktory, ktoré môžu zohrávať úlohu v diagnostickom procese, patria:
a) na strane pacienta – akútne zápalové ochorenie, dekompenzácia chronického ochorenia, ťažké aterosklerotické poškodenie ciev, hojenie poranení, pooperačné stavy, nadmerná fyzická záťaž, hormonálne zmeny… Otázny je vplyv dlhodobého fajčenia, ako aj prípadnej nadmernej psychickej záťaže.
b) na strane samotného vyšetrenia – spôsob odberu vzorky, ako aj čas jej vyšetrenia od odberu, parametre centrifugácie, počet trombocytov vo vyšetrovanej vzorke.

Z vlastných skúseností možno taktiež poznamenať, že aktivačný status trombocytov je do značnej miery ovplyvnený aj užívaním antitrombotickej terapie.

Medzi najčastejšie používané laboratórne metódy hodnotiace funkciu trombocytov patrí vyšetrenie pomocou agregometrie, či už na optickom, alebo impedančnom princípe. V našom laboratóriu používame za účelom zhodnotenia aktivačného stavu trombocytov aj vyšetrenie expresie aktivačných markerov pomocou prietokovej cytometrie.

Agregometrické vyšetrenie

Je zamerané na zhodnotenie prípadných odchýlok v procese agregácie trombocytov, či už v zmysle zvýšenej (hyperagregabilita trombocytov), alebo zníženej (hypoagregabilita trombocytov) agregačnej odpovede po ich stimulácii rôznymi typmi induktorov v presne stanovených koncentráciách.

Proces agregácie začína niekoľko minút po aktivácii a je výsledkom aktivácie receptora glykoproteínového komplexu GPIIb/IIIa, čo umožní väzbu s vWF alebo s fibrinogénom. (11) Jedna krvná doštička má na svojom povrchu približne 60 000 receptorov tohto typu. (12) Molekuly fibrinogénu a vWF slúžia ako mosty viažuce susedné trombocyty. Aktivovaný receptor GPIIb/IIIa po väzbe fibrinogénu dokáže intracelulárnou signalizáciou aktivovať ďalšie receptory GPIIb/IIIa. GPIIa/IIIb dokáže taktiež ukotviť trombocyt k subendotelovému vWF za účelom vyššej stability. Vzhľadom na jasné a kľúčové postavenie GPIIb/IIIa v procese agregácie trombocytov predstavuje ovplyvnenie jeho aktivity mechanizmus účinku mnohých antiagregačných liekov.

V klinickej praxi sa najčastejšie používa optická agregometria, ktorej princípom je meranie vzostupu transmisie svetla vo vyšetrovanej suspenzii trombocytov (v plazme bohatej na trombocyty) po pridaní exogénneho doštičkového induktora v závislosti od % agregovaných trombocytov. (14) Medzi najčastejšie používané induktory patria adenozíndifosfát, epinefrín, kolagén, kyselina arachidónová, trombín a ristocetín v presne stanovených koncentráciách.

Hypoagregabilita trombocytov sprevádza rôzne získané alebo vrodené stavy. Je spojená s krvácavými prejavmi, respektíve so zvýšeným rizikom krvácania. V prípade vrodených trombocytopatií, ktoré sú ale pomerne raritným nálezom, napríklad pri Bernardovom-Soulierovom (BS) syndróme s prevalenciou 1 prípad na 1 milión obyvateľov (13), je hypoagregabilita trombocytov trvalým nálezom a trombocyty vykazujú zníženú agregáciu v závislosti od konkrétneho vrodeného syndrómu – pre BS syndróm s deficitom glykoproteínového komplexu GPIb/V/IX je typická znížená až absentujúca agregácia po ristocetíne, pri Glanzmannovej trombasténii s deficitom glykoproteínového komplexu GPIIb/IIIa je signifikantne znížená agregácia po kolagéne, epinefríne aj po adenozíndifosfáte so zachovanou agregáciou po ristocetíne. Diferenciálna diagnostika vrodených trombocytopatií na základe výsledku agregometrického vyšetrenia je uvedená v Tabuľke č. 2.

Pri získanej trombocytopatii s hypoagregabilitou ide o dočasný nález a po odstránení vyvolávajúcej príčiny dochádza k úprave agregačnej odpovede. V klinickej praxi sa s hypoagregabilitou trombocytov stretávame najmä v teréne užívanej protidoštičkovej liečby, kde je žiadúcim fenoménom, ale vyskytuje sa aj ako následok užívanej analgetickej a protizápalovej liečby, pri myeloproliferatívnych ochoreniach, pri hepatopatii, monoklonálnych gamapatiách i pri systémových ochoreniach. (3)

Hyperagregabilita trombocytov je naopak charakterizovaná ako stav zvýšenej reaktivity trombocytov po ich stimulácii induktormi. Považuje sa za predispozíciu, rizikový faktor trombotických, najmä artériových komplikácií. Táto vlastnosť trombocytov, označovaná aj ako syndróm lepivých trombocytov/doštičiek (SPS), môže byť buď získaná (pri zápalových ochoreniach, po operáciách, pri hojení rán, pri hormonálnej nerovnováhe, v tehotenstve…), alebo sa môže vyskytovať na vrodenom podklade. Aj keď v súčasnosti ešte nepoznáme konkrétny gén alebo súbor génov, ktoré sú jednoznačne zodpovedné za vrodenú hyperagregabilitu trombocytov, hereditárny pôvod je vysoko suspektný najmä v rodinách s podobným a pretrvávajúcim agregometrickým obrazom u viacerých jej členov pri súčasne zvýšenom výskyte trombotických komplikácií v týchto rodinách.

Vyšetrenie agregácie trombocytov je súčasťou skríningu trombofilného stavu realizovaného v hematologických ambulanciách. Hyperagregabilita je laboratórne definovaná ako zvýšená agregabilita krvných doštičiek in vitro v reakcii po stimulácii nízkymi koncentráciami ADP a/alebo epinefrínu. Agregácia po ostatných typoch induktorov ostáva fyziologická. (14) Pri diagnostike hyperagregability sa využíva ADP vo finálnych koncentráciách 2,34 µM, 1,17 µM a 0,58 µM. Epinefrín v koncetráciách 11 µM, 1,1 µM a 0,55 µM. Na základe výsledného percenta agregovaných trombocytov po jednotlivých typoch induktorov rozoznávame konkrétne podtypy syndrómu lepivých trombocytov.

Z hľadiska klinickej praxe má veľký význam monitoring účinnosti protidoštičkovej liečby. Vyšetrenie je indikované najmä u pacientov po recidivujúcich trombotických komplikáciách napriek antiagregačnej terapii – pacienti s recidivujúcimi tranzitórnymi ischemickými atakmi, ischemickými cievnymi mozgovými príhodami, s infarktmi myokardu či po trombotickom uzávere cievnych stentov v rôznych lokalizáciách. Najčastejšie sa v rámci sekundárnej prevencie artériových trombotických komplikácií používa ASA. Pri podozrení na tzv. aspirínovú rezistenciu sa agregometria po stimulácii kyselinou arachidónovou javí ako najvhodnejšia metóda stanovenia protidoštičkového účinku ASA. Za účinnú sa liečba považuje, ak dochádza k útlmu agregácie pod 25 %. (14) Pri liečbe pomocou tienopyridínov (klopidogrel, prasugrel, ticagrelor…) sa môže tiež vyskytnúť fenomén rezistencie. Pri podozrení na rezistenciu sa v tomto prípade vyšetruje stimulácia po ADP s prostaglandínom E1 v koncentrácii 10 mol/l. Za účinnú sa považuje inhibícia agregácie pod 45 %. (14)

Využitie imunofenotypového vyšetrenia na posúdenie aktivačného stavu trombocytov

Na posúdenie imunofenotypových charakteristík buniek sa využíva prietoková cytometria (PC). Ide o techniku rýchlej analýzy špecifických charakteristík rôznych buniek pomocou merania ich veľkosti a granularity. Ponúka informácie o funkčnom stave trombocytov in vivo a vypovedá aj o aktivačnom stave trombocytov, o trombopoéze, pomáha diagnostikovať špecifické ochorenia a taktiež monitorovať protidoštičkovú terapiu.(5, 15) Využíva optické a fluorescenčné fyzikálne princípy za účelom detekcie povrchových receptorov typických pre aktiváciu trombocytov, sekrečných molekúl a trombocytových, ako aj leukocyto-trombocytových agregátov. Základným princípom vyšetrenia je väzba fluorescenčne značenej protilátky na špecifický proteín na povrchu vyšetrovanej bunky alebo v jej cytoplazme. Laserový lúč prechádza pretekajúcou vzorkou a excituje na vyššiu energetickú úroveň na bunkách naviazané molekuly fluorescenčných farbív (fluorochrómov), ktoré pri spätnom prechode do neexcitovaného stavu emitujú svetelnú energiu rôznej vlnovej dĺžky. Použitie viacerých fluorochrómov, ktoré absorbujú svetlo podobnej vlnovej dĺžky, ale emitujú svetlo rozličnej vlnovej dĺžky, umožňuje simultánnu detekciu viacerých vyšetrovaných znakov. (5) Prietoková cytometria môže byť užitočná aj pri diagnostike už vyššie spomínaných vrodených (napríklad Bernardov-Soulierov syndróm, Glanzmannova trombasténia) alebo získaných dysfunkcií trombocytov (napríklad heparínom indukovaná trombocytopénia – HIT) a porúch sekrécie. Umožňuje analýzu aj v prípade nízkeho počtu doštičiek. (5) Taktiež umožňuje rozpoznať prokoagulačnú kapacitu a aktivačný stav trombocytov (pacienti s akútnym koronárnym syndrómom alebo extratelovým obehom). V rámci monitorovania účinnosti protidoštičkovej liečby tienopyridínmi sa najčastejšie hodnotí fosforylácia VASP (Vasodilator-stimulated protein). (5) V transfuziológii sa používa na zhodnotenie aktivovaného stavu trombocytov, ako aj na identifikáciu prípadnej kontaminácie trombocytových koncentrátov leukocytmi. (16)

CD antigény – Clusters of differentiation
Ide o rôzne povrchové alebo cytoplazmatické molekuly s rôznou funkciou, ktoré sú typické pre skúmanú bunku v určitom vývojovom období, prípadne v určitom funkčnom stave. CD antigény môžu patriť medzi receptory alebo ligandy. Niektoré CD antigény nie sú zapojené do signalizačných dráh, môžu mať mnohé iné funkcie – napríklad sú dôležité pri adhézii buniek. Mnohé CD antigény sú predmetom výskumu, lebo predstavujú potenciálny terapeutický cieľ za účelom ovplyvnenia signalizačných dráh a správania bunky.

CD antigény typické pre trombocyty
Expresia povrchových CD antigénov trombocytov sa líši v závislosti od stavu vyšetrovaného trombocytu. Povrchové CD antigény, ktoré sú prítomné na trombocytoch pred ich aktiváciou, sa považujú za špecifické doštičkové znaky a slúžia na identifikáciu populácie trombocytov vo vyšetrovanej vzorke. Za takéto diferenciačné znaky možno považovať antigény CD41, CD42, CD61, CD36.

Ako bolo uvedené vyššie, v procese aktivácie trombocytov dochádza na povrchu trombocytu k expresii mnohých špecifických CD antigénov, ktorá je často výsledkom uvoľnenia obsahu α-granúl trombocytov. Tieto znaky sa nenachádzajú na neaktivovaných trombocytoch, preto môžu slúžiť ako špecifický marker ich aktivácie. V našom laboratóriu využívame najmä detekciu antigénov CD63 (vyšetrovaný v koexpresii CD36/CD63), CD62P – P-selektínu, CD49b, CD31 a CD51. (19)

Aktivácia trombocytov sa vyskytuje počas vývoja aterosklerózy, ako aj v čase formovania trombu pri akútnej manifestácii aterosklerotickej choroby. (20) Optimálne zhodnotenie aktivačného stavu trombocytov predstavuje výzvu, no znamená jednoznačný prínos z hľadiska identifikácie pacientov, ktorí sa nachádzajú v riziku ďalších kardiovaskulárnych príhod v budúcnosti. (20) Prietoková cytometria sledujúca expresiu molekúl typických pre aktiváciu trombocytov (P-selektín, CD63) alebo zmenu konformácie (GPIIb-IIIa) patrí medzi priame metódy sledujúce funkčné vlastnosti trombocytov. Nepriame vyšetrovacie metódy merajú ex vivo funkciu trombocytov s predpokladom rovnakého správania trombocytov in vivo (agregácia a adhézia a sekrečná odpoveď po aktivácii). Vykazujú však pomerne slabú koreláciu s priamymi vyšetrovacími metódami. (20) In vitro bola dokázaná asociácia medzi sekrečnou reakciou a uvoľnením mikropartikúl (MPs) z trombocytov (platelet-derived MPs – PMPs). (22) Počet cirkulujúcich PMPs odráža aktivačný status doštičiek in vivo, napríklad v prípade pacientov s chorobou periférnych artérií (21), s nestabilnou anginou pectoris, s infarktom myokardu, po cerebrovaskulárnych príhodách a s diabetom. (20) Ukazuje sa, že subpopulácie PMPs (exprimujúce P-selektín alebo CD63) môžu byť novým markerom aktivácie trombocytov in vivo. Funkčné poruchy trombocytov sa v dominantnej miere spájajú so vznikom artériovej trombózy. V prípade venózneho tromboembolizmu (VTE) a jeho patofyziológie zohráva úlohu najmä poškodenie endotelu, stáza krvi a navodený hyperkoagulačný stav.

Vyšetrenie agregácie trombocytov má, ako už bolo uvedené, jasne definované referenčné hodnoty a v prípade potvrdenia hyperagregability trombocytov následne (podľa klinických ťažkostí) pristupujeme k zahájeniu adekvátnej liečby, prípadne prevencie. Pri negatívnom výsledku agregometrie a pretrvávajúcich klinických ťažkostiach sme sa rozhodli pristúpiť k hodnoteniu aktivačného stavu trombocytov našich pacientov pomocou prietokovej cytometrie. Viedli nás k tomu výsledky analýzy parametrov získaných v populácii pacientov v našej hematologickej ambulancii. Keďže neexistuje jasne definované referenčné rozmedzie fyziologickej expresie antigénov, za kontrolný súbor sme si zvolili skupinu 33 žien bez klinických ťažkostí, ktoré boli v našej ambulancii vyšetrované len z dôvodu pozitívnej rodinnej anamnézy na výskyt trombotickej alebo tehotenskej komplikácie. Kontrolný súbor sme porovnávali s dvoma vyšetrovanými súbormi. Prvý tvorilo 50 pacientok s tehotenskými komplikáciami, druhý 50 žien so suspektnými alebo evidentnými trombotickými komplikáciami. Charakteristiku jednotlivých súborov zobrazuje Tabuľka č. 3, spektrum trombotických komplikácií Graf č. 1.

Z vyššie uvedených vyšetrovaných a sledovaných trombocytových znakov sme sa zamerali na analýzu expresie CD62P (P-selektínu), ktorý sa uvoľňuje z α-granúl po aktivácii trombocytov a následnej degranulácii. Ako druhý parameter bola vyhodnocovaná koexpresia znakov CD36/CD63 – CD36 ako konštitučný znak krvných doštičiek, znak CD63 ako prejav ich aktivácie. (2)

Výsledky štatistickej analýzy rozdielov v expresii CD62P medzi pacientkami s trombotickými a pacientkami s tehotenskými komplikáciami nedokázali štatisticky významné rozdiely (p = 0,124619). Pozorujeme však štatisticky významné rozdiely v expresii CD62P medzi pacientkami s tehotenskými komplikáciami a kontrolným súborom (p < 0,001), ako aj medzi pacientkami s trombotickými komplikáciami a kontrolami (p < 0,001). (2)

Podobná situácia bola zaznamenaná aj pri analýze koexpresie CD36/CD63. Medzi dvoma sledovanými súbormi symptomatických pacientok nebol zachytený štatisticky významný rozdiel v sledovanom parametri (p = 0,202745). Naopak, rozdiely v koexpresii CD36/CD63 medzi asymtomatickými kontrolami a pacientkami s tehotenskými, ako aj s trombotickými komplikáciami boli štatisticky významné (p < 0,001). (2)

Vyššie uvedené vyšetrenia neboli realizované v čase akútnych trombotických komplikácií, ale až po ich preliečení. Takisto v prípade výskytu tehotenských komplikácií sa pristúpilo k analýze minimálne 3 mesiace po ich prekonaní. Prejavy pretrvávajúcej a signifikantne zvýšenej aktivácie trombocytov aj po tehotenstve/preliečení trombózy by mohli znamenať pretrvávajúce zvýšené riziko recidívy ťažkostí. Či by mohla zvýšená expresia TRAMS slúžiť ako prediktívny faktor ďalších následných tehotenských komplikácií u pacientok s pozitívnou gynekologickou anamnézou, alebo byť indikátorom tromboprofylaxie pri inak negatívnom výsledku skríningu trombofilného stavu, je zatiaľ v rovine špekulácií. (2) Môže byť ale nápomocnou informáciou pri zvažovaní predĺženej liečby HVT u rizikových pacientov, prípadne u antitrombotickej profylaxie v nasledujúcom tehotenstve.

Záver

Spomenuté laboratórne metódy predstavujú základné spektrum vyšetrovacích metód so zameraním na trombocyt, ktoré sú momentálne dostupné v rámci bežnej diagnostiky možných porúch hemostázy. Zmeny v niektorých parametroch odhaľujú závažnú funkčnú poruchu, niektoré zmeny sa považujú za predispozíciu, respektíve možný rizikový faktor trombotických komplikácií. V súčasnej dobe však pribúda veľa informácií o ďalších možných parametroch, ktoré by mohli zohrávať úlohu vo včasnej diagnostike, ako aj v prevencii trombotických komplikácií, preto možno očakávať, že sa toto spektrum vyšetrení bude stále viac a viac rozširovať s cieľom čo najadresnejšej liečby pre každého pacienta.

Literatúra

1. Michelson AD. et al. Platelets. Academic, 2013, 3rd Edition, s. 1398, ISBN: 9780123878380.
2. Jedináková Z. Expresia aktivačných markerov trombocytov pacientiek s tehotenskými a/alebo trombotickými komplikáciami. Špecializačná práca. Martin: Univerzita Komenského, 2020, s. 55
3. Sakalová A., Bátorová A., Mistrík M. et al. Klinická hematológia, Martin: Osveta, 2010, s. 295, ISBN 978-80-8063-324-0.
4. Briggs C, Bain BJ et al. Basic Haematological Techniques, Dacie and Lewis Practical Haematology (Twelfth Edition), 2017.
5. Paniccia R., Priora R., Liotta AA. Et al. Platelet function tests: a comparative review, Vasc Health Risk Manag. 2015; 11: 133-148.
6. Middeldorp S. Evidence-based approach to thrombophilia testing. J Thromb Thrombolysis 211; 31(3): 275-281.
7. Boekholdt SM, Kramer MH. Arterial thrombosis and the role of thrombophilia. Semin Thromb Hemost. 2007;33(6):588–596. doi: 10.1055/s-2007-985755.
8. Bezemer ID, Meer FJ, Eikenboom JC, Rosendaal FR, Doggen CJ. The value of family history as a risk indicator for venous thrombosis. Arch Intern Med. 2008; 169(6): 610-615. doi: 10.1001/archinternmed.2008.589.
9. Robertson L., Wu O., Langhorne P. et al. Thrombophilia in pregnancy: a systematic review. Br J Haematol. 2006; 132(2): 171-196. doi: 10.1111/j.1365-2141.2005.05847.
10. Kaandorp SP., Di Nisio M., Goddijn M. et al. Aspirin or anticoagulants for treating recurrent miscarriage in women without antiphospholipid syndrome. Cochrane Database Syst Rev 2009 (1): CD004734.
11. Yip J., Shen Y., Berndt MC., Andrews RK. et al. Primary platelet adhesion receptors. Life. 2005, 57 (2): 103-8. doi:10.1080/15216540500078962.
12. O'Halloran AM., Curtin R., O'Connor F. et al. The impact of genetic variation in the region of the GPIIIa gene, on Pl expression bias and GPIIb/IIIa receptor density in platelets. British Journal of Haematology 2006; 132 (4): 494-502. doi:10.1111/j.1365-2141.2005.05897.x.
13. https://en.wikipedia.org/wiki/Bernard–Soulier_syndrome
14. Škorňová I., S lavík L. et al. Hemostáza, P+M, 2020, s. 285, ISBN 978-80-89694-78-5.
15. Michelson AD, Newburger PE et al. Platelets and leukocytes: aggregate knowledge. Blood, 2007; 110: 794-795.
16. Middelburg RA., Roest M., Ham J. et al. Flow cytometric assessment of agonist-induced P-selectin expression as a measure of platelet quality in stored platelet concentrates. Transfusion, 2013; 53: 1780-1787.
17. https://www.researchgate.net/figure/Scanning-electron-micrographs-of-A-resting-37-C-and-B-temperature-activated-20_fig7_6923881
18. https://imagebank.hematology.org
19. https://sinobiological.com
20. Van der Zee PM., Biró E., Ko Y. et al: P-selectin- and CD63-exposing platelet microparticles reflect platelet activation in peripheral arterial diseaseand myocardial infarction. Clinical Chemistry 2006; 52: 657-664.
21. Zeiger f., Stephan S., Hoheisel G. et al. P-selectin expression, platelet aggregates and platelet-derived microparticle formation are increased in peripheral arterial disease. Blood Coagul Fibrinolysis 2000; 11: 723-8.
22. Michielson AD., Barnard MR., Hechtman HB. et. al. In vivo tracking of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface P-selectin but continue to circulate and function. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 11877-82.