Unilabs Slovensko sa v máji 2025 zúčastnil najväčšej európskej genetickej konferencie roka, ktorá sa tentoraz konala v Miláne. Okrem štvordňového konferenčného programu sa viacerí z výpravy zúčastnili aj predkonferenčného workshopu zameraného na analýzu sekvenačných dát v klinickom prostredí. V tomto článku prinášame zhrnutie najdôležitejších poznatkov, ktoré pravdepodobne ovplyvnia lekársku genetiku v najbližších rokoch.

Úvod

Európska spoločnosť pre genetiku človeka (European Society of Human Genetics, ESHG) bola založená v roku 1967 s cieľom združovať profesionálov pôsobiacich v oblasti lekárskej genetiky a genetiky človeka. Táto nezisková organizácia podporuje výskum v oblasti základnej, ako aj aplikovanej lekárskej genetiky a genetiky človeka, rozvoj a zabezpečenie vysokých štandardov v klinickej praxi a podnecuje nadväzovanie kontaktov medzi všetkými, ktorí zdieľajú tieto ciele. Za týmto účelom ESHG organizuje počas roka niekoľko vzdelávacích po­dujatí, z ktorých najvýznamnejším je European Human Genetics Conference (Európska konferencia genetiky človeka). Tento rok sa toto stretnutie konalo v talianskom Miláne, a to od 24. do 27. mája. S cieľom podporiť kontinuálne vzdelávanie našich zamestnancov a dozvedieť sa o najrelevantnejších pokrokoch v odbore sa tejto udalosti zúčastnila aj početná skupina z Unilabs – 10 laboratórnych diagnostikov, 5 lekárskych genetikov, ako aj zástupcovia obchodného oddelenia.

Program konferencie pozostával zo 6 plenárnych prednášok (vyvrcholením bola Mendelova prednáška, ktorú predniesla profesorka Katalin Karikó, laureátka Nobelovej ceny za rok 2023 za objav mRNA vakcín), 9 vzdelávacích blokov, 29 paralelných sympózií, 17 workshopov, 37 paralelných sekcií a mnohých firemných prezentácií. Účastníci mali navyše prístup do výstavnej zóny, kde približne 160 firiem predstavilo medzi inými svoje produkty z oblasti sekvenovania, automatizácie, mikroskopie a analytických softvérov. Taktiež bolo možné sa zapojiť do predkonferenčného workshopu, ktorý sa venoval klinickej interpretácii sekvenačných dát. Táto zásadná genetická udalosť účastníkom ukázala, akým smerom sa bude lekárska genetika uberať v nasledujúcich rokoch.

Predkonferenčný kurz

Veľká skupina odborníkov z Unilabsu, laboratórnych diagnostikov aj lekárskych genetikov, sa zúčastnila workshopu pred samotnou konferenciou. Išlo o workshop s názvom „Clinical NGS Data Interpretation Course“, ktorý bol zameraný na analýzu dát z masívneho paralelného sekvenovania s cieľom stanovenia klinickej diagnózy pacienta. Účastníci kurzu ocenili interaktívny prístup, keďže organizátori pripravili pre účastníkov klinické prípady z reálnej praxe, na ktorých si vyskúšali možnosti najnovších počítačových programov zameraných na analýzu genomických dát. Workshop trval 2 dni, v prvom dni sa účastníci zaoberali celoexómovým a celogenómovým sekvenovaním, s analýzou mutácií typu SNV a CNV. Témou druhého dňa boli varianty nejasného významu a náhodné a sekundárne nálezy v rámci vyšetrení typu WES a WGS. V závere sa kurz zaoberal aj základmi novej genetickej laboratórnej metódy, tzv. long-read sekvenovania.

Pohľad lekárskeho genetika

1. deň konferencie
Konferencia začala prvým programovým blokom o 8:30, mojím výberom v tejto sekcii bol blok zaoberajúci sa genetickými správami z genetického laboratória. Odporúča sa, aby mala správa jasnú a logickú štruktúru v rozsahu 1-2 strán, s jasným výsledkom vo vzťahu ku klinickej otázke na začiatku a s technickými informáciami v druhej časti správy. Laboratórium musí mať pripravený protokol, ako sa vysporiadava s náhodnými a sekundárnymi nálezmi. Napriek snahe o jasný nález vyžaduje porozumenie správe z genetického laboratória aspoň základné znalosti lekárskej genetiky, aj to je jedným z dôvodov obmedzenia indikácií genetických laboratórnych vyšetrení. Ďalším blokom s mojou účasťou bola implementácia genomiky v rôznych klinických situáciách. V tejto časti boli rozoberané rôzne pilotné projekty zamerané na genomický novorodenecký skríning. Tieto projekty prebiehajú vo viacerých vyspelých krajinách, veľký dôraz sa kladie na komunikáciu s rodinami, na ktorú sa využívajú rôzne online nástroje. Je nevyhnutné, aby mal tento typ skríningu podporu širokej verejnosti. Prvý deň popoludní bol oficiálny otvárací blok a časť venovaná novinkám. V tejto časti ma zaujala prednáška zaoberajúca sa lepším pochopením Huntingtonovej choroby s naznačením možného prístupu k liečbe a prednáška o paleogenetike a archeogenetike, ktorá sa venovala genetickému výskumu starej európskej populácie a neandertálcom.

2. deň konferencie
Mojím prvým blokom druhého dňa boli štrukturálne chromozómové varianty. Prednášky poukázali na význam metódy WGS, ktorá v tomto prípade pacientom aj lekárom šetrí čas i náklady na diagnostiku. Pri analýze nejasných prípadov je vhodné pozrieť sa na výsledky celej rodiny a aj na jednotlivé gény v rámci delécií alebo duplikácií. Celý ďalší blok bol venovaný novej skupine ochorení spôsobených mutáciami v génoch kódujúcich niektoré formy snRNA. Ide o gény nachádzajúce sa v oblastiach nepokrytých pri celoexómovom sekvenovaní, na diagnostiku treba použiť analýzu WGS alebo cielenú diagnostiku konkrétnych génov. Príznaky pacientov sú nešpecifické – hypotónia, zaostávanie vo vývine, mentálne zaostávanie, porucha vývinu reči a chôdze, neprospievanie, epilepsia, anomálie CNS, objavujú sa pacienti s retinitis pigmentosa.

V popoludňajšom bloku ma zaujala časť o somatických mutáciách. Okrem významu somatických mutácií pre onkologické ochorenia sa ukazuje, že tieto mutácie by mohli mať význam aj v procese starnutia a pri rôznych zápalových ochoreniach. To by mohlo predstavovať nový smer v liečbe „negenetických“ ochorení ako reumatoidná artritída. Ďalšia prednáška sa pozrela na známy fakt kratšieho života mužov v porovnaní so ženami cez stratu Y chromozómu v hematopoetických bunkách. Tento nález je spojený so zvýšeným rizikom niektorých ochorení, ako sú kardiovaskulárne ochorenia, rakovina a Alzheimerova choroba. Pre lepšie pochopenie súvislostí treba ešte ďalší výskum.

Môj posledný blok mal názov „Penetrancia a expresivita“. Prednášky sa zaoberali variabilnými prejavmi pri niektorých dedičných nádorových syndrómoch, kardiomyopatiách a CNV nálezoch.

3. deň konferencie
Hneď prvý blok, ktorý som absolvoval, bol výrazne klinicky orientovaný – spolupráca endokrinológov a genetikov pri riešení nízkeho vzrastu, téma, ktorá je v praxi veľmi častá. Etiológia aj z pohľadu genetiky je rôznorodá, patria tam chromozómové anomálie, rôzne syndrómy spôsobené monogénovými ochoreniami, bližšie boli rozoberané metylačné ochorenia ako Silverov-Russellov syndróm a Templeovej syndróm. Posledná prednáška v bloku prezentovala pokroky v liečbe. Okrem už dlho používaného rastového hormónu sa objavujú lieky súvisiace s génom FGFR3 ako vazoritid, infigratinib, navepegritid, časť z nich zatiaľ len v štádiu klinických skúšaní. Predpokladá sa, že okrem achondroplázie budú účinné aj pri iných diagnózach.

Ďalší blok sa venoval novým možnostiam liečby genetických ochorení, vaskulárnej forme syndrómu Ehlers-Danlos a použitiu tzv. ASO terapie pri niektorých vzácnych ochoreniach. Veľmi povzbudzujúci bol efekt génovej terapie na závažnú formu OTC deficitu.

4. deň konferencie
Posledný deň konferencie bol hlavne rozlúčkový. Odborný program bol kratší, zaujal ma blok venovaný fetálnemu fenotypovaniu. Tento spôsob stanovenia fenotypu bol rozobratý z pohľadu patológa realizujúceho fetálnu autopsiu, z pohľadu rádiológa a využitia rôznych zobrazovacích metód ako ultrasonografia, magnetická rezonancia, RTG a CT vyšetrenia. Ako nová a sľubná metóda sa ukazuje micro-CT vyšetrenie s kontrastom. Posledná prednáška bloku sa venovala správnemu fenotypovaniu plodu z pohľadu ošetrujúceho gynekológa a využitiu HPO termínov zameraných na prenatálny fenotyp.

Pohľad laboratórneho diagnostika

„Long reads“ a ich pridaná hodnota v genetickej diagnostike
Štandardne sa dnes v klinickej praxi na sekvenovanie DNA používajú technológie, ktoré generujú veľmi presné dáta, no jednotlivé čítania sú obmedzené dĺžkou len na niekoľko stoviek nukleotidov. Preto sa tento typ označuje ako sekvenovanie s krátkym čítaním (short-read sequencing). Hoci má v odbore stále pomerne monopolné postavenie, technologický vývoj sa nezastavil a čoraz častejšie sa začínajú používať sekvenátory tretej generácie, schopné tzv. dlhého čítania (long-read sequencing). Okrem oveľa dlhších čítaní ponúkajú výhody ako sekvenovanie jednotlivých DNA molekúl v reálnom čase a možnosť priamej detekcie DNA modifikácií (napr. metylácie DNA, ktorá reguluje prepis genetickej informácie z DNA do RNA – tzv. transkripciu). „Long reads“ boli horúcou témou tohtoročného ESHG – boli predmetom vzdelávacích, paralelných i viacerých firemných prezentácií, ktorých som sa zúčastnila.

Počas firemných prezentácií sme sa oboznámili s princípmi dostupných metód (Obrázok č. 1). Oxford Nanopore Technologies (ONT) využíva na sekvenáciu nanopóry, ktoré sú začlenené do biofilmu. Medzi oboma stranami biofilmu je elektrické napätie a keď jednotlivé jednovláknové molekuly DNA prechádzajú nanopórom, namerané zmeny elektrického prúdu slúžia na to, aby sa určila sekvencia DNA (1). Táto metóda produkuje ultra dlhé čítania (aj niekoľko miliónov nukleotidov), je cenovo dostupná, no stále pomerne chybová v porovnaní s inými metódami. PacBio ponúka sekvenovanie jednej molekuly v reálnom čase (SMRT – single-molecule real-time sequencing (2)), ktoré prebieha v nanokomôrkach, kde sa zachytia jednotlivé DNA fragmenty. Počas amplifikácie DNA polymeráza inkorporuje značené nukleotidy, pričom sa uvoľňuje svetlo, ktoré sa meria v reálnom čase. Vznikajúce sekvencie dosahujú dĺžku až 20 000 báz, sú veľmi presné, no technológia je zatiaľ výrazne drahšia než konkurenčné metódy.

Sekvenovanie s dlhým čítaním prináša v klinickej praxi logický posun k charakterizácii celého genómu, namiesto zamerania sa len na jeho kódujúcu časť (exóm), čo bolo taktiež predmetom mnohých prednášok na ESHG konferencii. Vďaka čítaniu naozaj dlhých DNA úsekov je výrazne jednoduchšie identifikovať štrukturálne varianty v genóme, ako sú delécie, inzercie a translokácie (3), ktoré sa veľmi ťažko odhaľujú pri použití krátkych čítaní a pritom sú kauzálne u dôležitej časti genetických ochorení. S krátkymi čítaniami totiž musí mať človek aj kúsok šťastia, aby v rámci jedného čítania zachytil ako bod zlomu, tak aj dostatočne dlhé presahy po oboch stranách bodu zlomu, aby ich bolo možné jednoznačne namapovať k referencii a takto identifikovať, k akej genómovej prestavbe došlo. Rovnako je jednoduchšie identifikovať expanziu repetícií (repeat expansions) a určiť ich presný počet – čo je tiež významné pre klinickú diagnostiku (4, 5).

Získavanie dlhých čítaní ide ruka v ruke s jednoduchším fázovaním sekvenčných dát. Fázovanie znamená určenie, ktoré alely na rôznych miestach chromozómu boli zdedené spolu – buď od matky, alebo od otca. Vďaka prítomnosti heterozygotných alel, ktoré sa v genóme náhodne nachádzajú v pravidelných intervaloch (približne každých 1 – 1,5 kb), dokážeme s pomocou dlhých čítaní pospájať genetické dáta do kompletne sfázovaných chromozómov (6). To následne uľahčuje potvrdenie zloženého heterozygota (dve mutácie ovplyvňujúce rozdielne alely) napríklad v prípade autozómovo recesívnych ochorení alebo identifikáciu „druhého zásahu“ v tumor supresorových génoch v nádorových bunkách.

Nová pangenómová referencia – dlhšia o 200 Mb. Zložitejšia, ale presnejšia

Ľudský referenčný genóm je základným nástrojom genetiky človeka – slúži ako voľne dostupný systém súradníc, doplnený o anotácie aj ďalšie informácie nad rámec samotnej sekvencie. Už v čase jeho publikácie v roku 2001 bolo známe, že technicky nebolo možné osekvenovať úplne celý genóm a že v referencii chýba približne 200 miliónov báz, najmä z centromerických a telomerických oblastí bohatých na repetície. V roku 2022 kombinácia presných dlhých čítaní (PacBio) a ultra-dlhých čítaní (ONT) umožnila tieto medzery doplniť (7). Použitie tejto novšej referencie vedie k presnejšej identifikácii genetických zmien aj k lepšiemu zachyteniu zmien počtu kópií génov a štrukturálnych variantov v genóme.

Referenčná sekvencia odvodená od jednej vzorky (7) však môže vnášať systematickú chybu do genetických analýz, pretože nedokáže reprezentovať genetickú diverzitu ľudskej populácie. Preto vznikli iniciatívy na vytvorenie novej pangenomickej referencie, ktorá má reprezentovať ľudstvo ako celok výberom a osekvenovaním väčšieho množstva jedincov reflektujúcich globálnu genetickú rozmanitosť. Táto nová referencia umožní identifikovať zdieľané oblasti i genetické varianty (bodové zmeny, inverzie, inzercie a delécie) v rámci rôznych haplotypov. Jednou z iniciatív je Human Pangenome Project (humanpangenomeproject.org), ktorý bol na ESHG predstavený počas jednej z plenárnych prednášok v prvý deň konferencie. Jeho cieľom je pracovať s vysokokvalitnými genomickými dátami pochádzajúcimi od viac než 350 osôb (t. j. viac ako 700 haplotypov) a integrovať ich do finálnej referencie. Používajú sa na to rôzne technológie – sekvenovanie krátkych čítaní, ONT, PacBio. V súčasnosti sú už dostupné dáta 200 jedincov a do roku 2026 je plánované dokončenie všetkých ďalších analýz a sprístupnenie novej referencie, ktorá by mohla nahradiť tú aktuálne používanú v klinickej praxi aj vo výskume. Táto nová referencia zároveň poslúži ako základ pre nový výskum v oblasti DNA modifikácií, pre reguláciu transkripcie a zlepší tiež presnosť identifikácie genetických zmien.

Diagnostická lupa – multimodálny pohľad na zriedkavé ochorenia

Aj skúsený diagnostik v rámci diagnostického procesu pracuje často s príliš dlhým zoznamom variantov a/alebo s príliš širokým klinickým obrazom na to, aby bez pochýb určil ten kauzálny – najmä, ak je zoznam plný variantov nejasného významu (VUS). V takýchto prípadoch môžu diagnostickému procesu významne pomôcť doplnkové „-omické“ technológie, ktoré umožňujú hĺbkovo preskúmať funkčné dôsledky genetických zmien. Tieto technológie dokážu vytvoriť komplexný obraz o skúmaných biologických molekulách (RNA, proteínoch alebo napríklad o metabolitoch) a poskytujú tak holistický pohľad na bunkové procesy. Porovnanie takýchto dát medzi pacientom a zdravou vzorkou môže napomôcť k výraznému zúženiu relevantných genetických nálezov. Na konferencii sme si mohli vypočuť nespočetné množstvo prezentácií, ako vedeckých, tak aj z klinického a diagnostického prostredia, zameraných na implementáciu práve takýchto „-omických“ prístupov v diagnostike.

Transkriptomika, ktorá profiluje molekuly RNA v biologickej vzorke, patrí medzi najrýchlejšie sa rozvíjajúce technológie v oblasti diagnostiky zriedkavých chorôb. Úspešne sa využíva ako doplnok k celoexómovému a celogenómovému sekvenovaniu v špecializovaných diagnostických centrách. Pomáha pri potvrdení VUS ako kauzálnych variantov, ako aj pri prioritizácii variantov, ktoré boli pôvodne prehliadnuté, no sú pravdepodobne patogénne. Vzhľadom na výrazný vplyv, ktorý môžu mať patogénne mutácie na expresiu génu, dokáže transkriptomika pomôcť identifikovať kauzálne genetické zmeny identifikovaním RNA s extrémnymi zmenami v hladinách expresie, ktoré sú funkčne prepojené s mechanizmami vzniku ochorenia.

Proteomika, ktorá umožňuje priamu kvantifikáciu proteínov, predstavuje vhodný doplnok k transkriptomike a analýze DNA. Patogénne mutácie so zmenou zmyslu (missense) zriedka vedú k zmenám hladín RNA, no často ovplyvňujú stabilitu samotného proteínu. Výrazne znížené hladiny proteínov môžu slúžiť ako dôležitý funkčný ukazovateľ dôsledkov týchto mutácií, ako aj regulačných variantov (8).

Záver

Lekárska genetika je odbor, ktorý napreduje neuveriteľnou rýchlosťou. Ešte pred niekoľkými rokmi bolo možné presne diagnostikovať len niektoré ochorenia, o terapii sa vtedy veľmi nehovorilo. V súčasnosti klesá podiel pacientov, ktorých nevieme dodiagnostikovať a naopak stúpa podiel pacientov, ktorým vieme ponúknuť nejakú formu liečby. Veríme, že tieto pokroky prinesieme – za spolupráce všetkých zainteresovaných – čo najskôr aj slovenským pacientom.

Literatúra

1. Wang Y et al. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nat Biotechnol. 2021 Nov;39(11):1348-1365. doi: 10.1038/s41587-021-01108-x. Epub 2021 Nov 8.
2. Ardiu S et al. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic Acids Res. 2018 Feb 1;46(5):2159–2168. doi: 10.1093/nar/gky066.
3. Kernohan KD et al. The expanding diagnostic toolbox for rare genetic diseases. Nat Rev Genet. 2024 Jun;25(6):401-415. doi: 10.1038/s41576-023-00683-w. Epub 2024 Jan 18.
4. Paulson H. Repeat expansion diseases. Handb Clin Neurol. 2018;147:105–123. doi: 10.1016/B978-0-444-63233-3.00009-9.
5. Theisen A et al. Disorders caused by chromosome abnormalities. Appl Clin Genet. 2010 Dec 10;3:159–174. doi: 10.2147/TACG.S8884.
6. Natsuga K. Advanced phasing techniques in congenital skin diseases. J Dermatol. 2025 Mar;52(3):392-399. doi: 10.1111/1346-8138.17597. Epub 2024 Dec 26.
7. Nurk S et al. The complete sequence of a human genome. Science. 2022 Apr;376(6588):44-53. doi: 10.1126/science.abj6987. Epub 2022 Mar 31.
8. Smirnov D et al. Integrative omics approaches to advance rare disease diagnostics. J Inherit Metab Dis. 2023 Sep;46(5):824-838. doi: 10.1002/jimd.12663.