Antinukleárne protilátky patria medzi najčastejšie indikované vyšetrenia protilátok. Pozitívne ANA protilátky nachádzame s vysokou prevalenciou a špecifitou pri širokom spektre rôznych autoimunitných ochorení. Použitím vhodnej metodiky a správneho postupu pri vyšetrovaní ANA protilátok môže byť výsledok pre indikujúceho lekára nenahraditeľný.
Úvod
Detekcia protilátok proti jadrám buniek (ANA) je dôležitým diagnostickým faktorom pri diagnostike mnohých autoimunitných ochorení. Protilátky proti jadrovým antigénom sú orientované proti rôznym komponentom a biochemickým substanciám v bunke jadra. Tieto protilátky sú charakteristické pre rôzne ochorenia. Klinický obraz vedie k podozreniu na autoimunitné ochorenie, vlastná diagnóza záleží na potvrdení laboratórnymi a ďalšími doplňujúcimi vyšetreniami. Pri liečbe ide obvykle o imunosupresívnu liečbu, v ktorej sa aplikujú kortikoidy buď v monoterapii, alebo v kombinácii s ďalšími imunosupresívami. (1) Prevalencia antinukleárnych protilátok pri zápalových reumatických ochoreniach je 20 – 100 %. Patria sem ochorenia ako systémový lupus erythematosus (SLE), Sharpov syndróm alebo zmiešané ochorenie spojivového tkaniva (MCTD – Mixed connective tissue disease, reumatoidná artritída (RA), progresívna systémová skleróza (SSc), polymyozitída, dermatomyozitída, Sjögrenov syndróm (SS). Dôležité antigény nachádzame aj pri autoimunitnej hepatitíde (AIH) a primárnej biliárnej cirhóze (PBC). Preto je diferenciálna diagnostika protilátok proti jadrovým antigénom nevyhnutná pri identifikácii jednotlivých reumatických ochorení, autoimunitných ochorení pečene a ich odlíšení od iných autoimunitných ochorení. (2)
Autoimunita
Autoimunitným imunopatologickým procesom je dlhodobo venovaná mimoriadna pozornosť prakticky vo všetkých lekárskych špecializáciách. Je to určené faktom, že autoimunitný poškodzujúci zápal je základom patofyziologických procesov, ktoré sa manifestujú ako často veľmi závažné autoimunitné imunopatologické ochorenia. Mnohé z nich sa manifestujú v produktívnom období života. S tým sú spojené zásadné negatívne dopady na úrovni individuálnej aj celospoločenskej. Autoimunitné ochorenia sa dostávajú – po ochoreniach obehovej sústavy a nádorových ochoreniach – na tretie miesto príčin morbidity a mortality ľudí v rozvinutých štátoch. (3)
Základným problémom, na ktorý pri autoimunitných chorobách hľadáme odpoveď, je definovať prvotnú príčinu, ktorá spustí celý komplex imunitných procesov vedúcich v konečnom dôsledku ku klinickému prejavu. (4)
Imunitný systém človeka za fyziologických podmienok neodpovedá na vlastné antigény poškodzujúcou imunitnou reakciou. Je to výsledok imunologickej tolerancie. Imunologická tolerancia vzniká už počas vývoja embrya. Vtedy sa časť autoreaktívnych klonov lymfocytov fyzicky odstráni. Druhá časť týchto potencionálne autoagresívnych klonov však zostane v pohotovosti a môže sa stimulovať mnohými antigénmi. Mechanizmy imunologickej tolerancie zaisťujú ochranu jedincov pred autoimunitnými chorobami. Tie vzniknú len u tých jedincov, u ktorých sa tieto mechanizmy stanú z rôznych vnútorných alebo vonkajších príčin nedostatočnými alebo nefunkčnými. (5) Autoimunitný poškodzujúci zápal je prienikom niekoľkých základných okolností, ktoré musia byť všetky naplnené, aby k iniciácii a rozvoji autoimunitného poškodzujúceho zápalu u daného jedinca došlo. Tieto predpoklady vedú k abnormálnej individuálnej imunitnej reaktivite, ktorá jedinca predisponuje k rozvoju autoimunity.
Na prvom mieste je genetická predispozícia, ktorá je nutnou podmienkou rozvoja autoimunitného poškodzujúceho zápalu. Na druhom mieste je vonkajšie a vnútorné prostredie človeka, ktoré pôsobí epigeneticky. Epigenetické mechanizmy ovládajú prepis génov. Ich prostredníctvom môžu byť konkrétne gény buď stimulované k prepisu, alebo potlačované. Treťou nutnou podmienkou pre vznik a rozvoj autoimunitných procesov sú abnormality spojené s dozrievaním T a B lymfocytov. V procese génového preskupovania vzniká obrovský základný repertoár receptorov TcR na T lymfocytoch a receptorov BcR na B lymfocytoch. Tieto základné repertoáre zahŕňajú kolóny T (B) lymfocytov, ktoré sú schopné s vysokou afinitou reagovať s vlastnými štruktúrami. Posledným významným segmentom, ktorý môže rozhodnúť o rozvoji autoimunitného poškodzujúceho zápalu, sú poruchy v neuroendokrinných reguláciách.
Väčšina autoimunitných ochorení sa s väčšou prevalenciou vyskytuje u žien, obvykle fertilného veku. Ženské pohlavné hormóny sú vo svojej dynamike dokázateľne zapojené v imunopatogenéze autoimunitných ochorení. (3) Všeobecne sa imunitná tolerancia ľahšie navodí u mužov než u žien. Estrogény podporujú vznik autoimunitných procesov. Estrogény pôsobia na bunkovú imunitu tlmivo, zvyšujú protilátkovú imunitnú odpoveď, zvyšujú syntézu IL-1, a tým podporujú zápalové procesy, zvyšujú expresiu adhezívnych molekúl v membránach endotelových buniek, a tak uľahčujú prechod zápalových buniek z krvi do tkaniva. Jedným z mechanizmov, ktorý tiež prispieva k preferenčnému vývinu autoimunitných procesov u žien, je aj vyššia hladina leptínu v ich plazme. Leptín pôsobí na CNS – uvoľňuje sa α-MSH (hormón stimulujúci melanocyty), ktorý stimuluje TH1-imunitnú odpoveď, a tak podporuje rozvoj autoimunity. (4)
Autoimunitné choroby je možné rozdeliť na systémové, charakterizované autoimunitnou reakciou proti orgánovo nešpecifickým autoantigénom a postihnutím viacero orgánov, a na orgánovo špecifické, u ktorých dochádza k autoreaktivite voči antigénom, ktorých expresia je obmedzená na určitý typ orgánu alebo tkaniva. Na hranici medzi týmito dvomi kategóriami stoja imunopatologické stavy, u ktorých je postihnutý prevažne jeden orgánový systém, ale sú sprevádzané celou radou systémových príznakov. U týchto chorôb sa vyskytujú väčšinou orgánovo nešpecifické autoprotilátky, ktorých výskyt je pomocným diagnostickým znakom. (6)
Antinukleárne protilátky
Autoprotilátky sú imunoglobulíny, ktoré sú namierené proti vlastným tkanivám. Cieľom sú pre nich rôzne štrukturálne súčasti buniek alebo ich produkty. Tvorba mnohých autoprotilátok je fyziologickým javom, ktorý nemusí viesť ku vzniku ochorení. Tieto tzv. prirodzené autoprotilátky sú obvykle prítomné v nižších titroch, majú relatívne nízku afinitu k odpovedajúcemu antigénu a väčšina patrí do triedy IgM. Autoprotilátky, ktoré sú asociované s patologickými stavmi, sú tvorené vo vyšších množstvách, majú väčšinou vysokú afinitu a sú najčastejšie tvorené izotypom IgG. Prítomnosť autoprotilátok v sére alebo v iných telových tekutinách môže pomôcť priamo diagnostikovať chorobu alebo podporiť túto diagnózu. (7)
ANA protilátky sú nešpecifické, zamerané na komplex rôznych nukleárnych antigénov. Cieľom ANA v bunke je chromatín (DNA, históny, ich komplex nazývaný nukleozóm a nehistónové proteíny, napríklad centroméry), jadrová membrána a póry, jadierko, ribonukleové kyseliny (RNA v komplexe s proteínmi), jadrový matrix, jadrová tekutina (obsahujúca množstvo rozpustných antigénov) a rôzne súčasti cytoplazmy. Pozitívne výsledky sa vyskytujú aj u zdravých starších ľudí, u tehotných žien, ďalej u pacientov s nádorovým ochorením, s chronickou infekciou a pri mnohých ďalších vážnejších ochoreniach. Protilátky sa objavujú mesiace alebo roky pred vypuknutím vlastnej choroby. Protilátky proti jadrovým antigénom (ANA) je možné nájsť na rôznych substrátoch. Na cielené stanovovanie a diferenciáciu antinukleárnych protilátok metódou nepriamej imunofluorescencie sa v súčasnosti uprednostňujú ľudské epitelové bunky HEp-2. HEp-2 bunky vykazujú široké spektrum ľudských jadrových protilátok a vyhodnotenie fluorescenčného obrazu umožňuje predbežnú diferenciáciu veľkého počtu protilátok. Jadrá buniek vykazujú zreteľnú fluorescenciu, ktorá má charakter špecifických obrazov. V prípade negatívnych vzoriek nevykazujú jadrá buniek žiadnu špecifickú fluorescenciu. V každom vyhodnocovanom poli je možné skúmať jadrá v metafáze a zároveň aj mitotické bunky v niekoľkých oblastiach. (8)
Nepriama imunofluorescenčná metóda (NIF) a metóda Imunoblot
NIF je dvojstupňová modifikácia priamej imunofluorescenčnej metódy. Je používaná na detekciu orgánovo špecifických a orgánovo nešpecifických protilátok z krvného séra pacienta. Antigénnym materiálom na NIF vyšetrenie je krv alebo krvné sérum pacienta. NIF metóda je uskutočňovaná na komerčne dostupných setoch obsahujúcich tkanivové rezy, tkanivové kultúry alebo bunkové nátery. Na vhodný antigénny substrát (tkanivové rezy, nátery) pôsobíme neznačenou protilátkou (sérom pacienta s predpokladanými protilátkami) namierenou proti tkanivovému antigénu. Vznikne komplex antigén/protilátka, ktorý nie je viditeľný vo fluorescenčnom mikroskope. Na vzniknutý komplex pôsobíme zvieracou protilátkou proti imunoglobulínom, ktorá je donorom tej prvej a je značená FITC. Prítomný FITC vizualizuje väzbu antigén/protilátka a je možné ju hodnotiť pod fluorescenčným mikroskopom.
Pri každom vyšetrení sa používa kontrolné sérum na zabezpečenie kontroly priebehu reakcie. Pri jednotlivých vyšetreniach sa vždy riadime pokynmi výrobcu a striktne dodržiavame jednotlivé návody, ktoré sú pribalené v každom komerčnom sete. Vyšetrenia sa vykonávajú na plne automatizovanom prístroji Sprinter XL od firmy Euroimmun. Automat využíva čítačku čiarových kódov na identifikáciu jednotlivých vzoriek, čím minimalizuje možnosť zámeny vzorky. Reakcie prebiehajú automaticky, od riedenia vzorky cez pipetovanie, inkubáciu až po premývanie.
Vyhotovené preparáty metódou NIF hodnotí laboratórny diagnostik na základe kvalifikácie a praktických skúseností. Rešpektujeme medzinárodný konsenzus na hodnotenie imunofluorescenčných obrazov a riadime sa pokynmi ICAP (International consensus on ANA patterns). Pri hodnotení sledujeme intenzitu a lokalizáciu imunofluorescenčnej reakcie v tkanive, typ imunofluorescencie a titer protilátok. Hodnotenie výsledkov imunofluorescenčnej reakcie zahrňuje kvalitatívny odhad intenzity špecifickej imunofluorescencie a morfológiu fluoreskujúcich štruktúr v tkanive. Súčasne rozlišuje autofluorescenciu, nešpecifickú väzbu konjugátu a kontrolné postupy.
Hodnotenie imunofluorescenčných metód je subjektívne a vyžaduje skúseného pracovníka a kvalitný fluorescenčný mikroskop. Titráciou je možné sledovať dynamiku ochorenia. Pri vyhodnocovaní ANA protilátok na HEp-2 bunkách treba poznať jednotlivé obrazy, ktoré sa dajú rozdeliť na jadrové, cytoplazmatické a mitotické.
Na základe medzinárodného konsenzu o hodnotení ANA protilátok je v súčasnosti klasifikovaných 29 jadrových obrazov, 9 cytoplazmatických a 5 mitotických. Nie všetky obrazy sa dajú jednoznačne zaradiť. Mnohé pozitívne séra pacientov vyhodnocujeme ako kombináciu 2 alebo aj viacerých obrazov a pre presné vyhodnotenie výsledku je preto potrebná dostatočná skúsenosť a teoretické znalosti.
Na vyšetrenie a špecifikáciu jednotlivých antigénov využívame metódu Imunoblot. Špecifikácia prebieha na testovacích stripoch s antigénmi a slúži na presnejšiu identifikáciu protilátok. Vykonáva sa na plne automatickom analyzátore Dynablot Automatic. Prístroj pipetuje vzorky z primárnych skúmaviek, suší stripy a sníma obraz pomocou kamery a skenera. Následne je výsledok vyhodnotený semikvantitatívne v programe EuroLineScan.
Po naskenovaní stripov z vyhodnocovacieho protokolu sa výsledky jednotlivých antigénov zobrazia v počítači v programe EURO LineScan kvantitatívne vo forme jednotiek a kvalitatívne v grafickej podobe, a to nasledovne: negatívna (−), slabo pozitívna (±), pozitívna (+), silno pozitívna (++; +++) reakcia.
Výsledky zaznamenáva laboratórny diagnostik do výsledkových listov. Následne vráti preparáty do laboratória a žiadanku do kancelárie na vyhotovenie a odoslanie výsledku a jeho archiváciu. Všetky výsledky z konfirmácií imunofluorescenčných vyšetrení sú v programe EURO Line archivované aj v elektronickej podobe.
Záver
Metóda nepriamej imunofluorescencie bola a stále je považovaná za „zlatý štandard“ pri vyšetrení ANA protilátok. Samostatné vyšetrenie ANA nepriamou imunofluorescenciou, len vo forme fluorescenčného obrazu, však neposkytuje pre indikujúceho lekára dostatočnú informáciu pre správne určenie diagnózy a následnú liečbu pacienta. Správne určenie fluorescenčného obrazu metódou nepriamej imunofluorescencie je základným predpokladom pre následné využitie metódy Imunoblot a dokázanie antigénov, ktoré sú vysoko špecifické pre konkrétne autoimunitné ochorenia. Dôležité je zachovať tento postup a najprv vzorku vyhodnotiť vo fluorescenčnom mikroskope.
Na základe fluorescenčného obrazu v mikroskope dokáže laboratórny diagnostik efektívne rozhodnúť ako následne postupovať v diagnostickom procese. Do úvahy tiež treba zobrať fakt, že niektoré antigény ešte neboli objavené a niektoré sa v súčasnosti z jadra extrahovať nedajú. To znamená, že bez využitia fluorescenčného mikroskopu a nepriamej imunofluorescencie nie je možné takéto ANA protilátky dokázať. V takomto prípade je teda výsledok nepriamej imunofluorescencie nenahraditeľný. V opačnom prípade, ak sa na dôkaz ANA protilátok využíva len samotná metóda Imunoblot, prípadne v súčasnosti často preferovaná metóda ELISA a neberie sa do úvahy fluorescenčný obraz, môžeme hovoriť len o skríningu a nie o komplexnej diagnostike ANA protilátok. Pri takomto type ANA skríningu dokážeme vyšetriť len vopred definované, obmedzené množstvo antigénov. V prípade, že sa tieto antigény vo vyšetrovanom sére pacienta nenachádzajú, neznamená to, že ANA protilátky sú negatívne. Tento fakt by sa preto vo výsledkovom liste nemal uvádzať ako ANA protilátky negatívne, pretože negatívne sú len vyšetrované antigény a nie celkové antinukleárne protilátky.
Kombinácia metód nepriamej imunofluorescencie a Imunoblot umožňuje komplexnú laboratórnu diagnostiku ANA protilátok. Tento postup je preferovaný a odporúčaný medzinárodným konsenzom (ICAP) o hodnotení ANA protilátok. Takto dokážeme vyšetriť fluorescenčný obraz a zároveň dokázať dôležité antigény. Profesionálnym prístupom, dostatočnými teoretickými vedomosťami, výberom správnej metodiky a precízne vykonanou prácou môže byť výsledok vyšetrenia ANA protilátok posledným kamienkom do mozaiky pre stanovenie diagnózy a úspešnú liečbu pacienta.
Použité skratky
MCTD: (mixed connective tissue disease) – Sharpov syndróm
SLE: systémový lupus erythematosus
SS: Sjögrenov syndróm
SSc: systémová skleróza
PBC: primárna biliárna cirhóza
RA: reumatoidná artritída
AIH: autoimunitná hepatitída
Literatúra
- BARTŮŇKOVÁ, J., PAULÍK a kol., 2011. Vyšetřovací metódy v imunologii. Praha: Grada Publishing, a. s. 33 s. ISBN 978–80-247–7089-5
- EUROIMMUN. Medizinische Labordiagnostika AG, 2023. EUROLINE ANA Profile 3 plus DFS70 (IgG) : Návod na provedení testu. [príbalový leták]. Lübeck. s. 10
- KREJSEK, J., 2016. Imunologie člověka. Hradec Králové : Garamon s. r. o. 223–226 s.
ISBN 978–80-86472–74-4 - BUC, M. 2005. Autoimunita a autoimunitné choroby. 1. vyd. Bratislava: VEDA. 87–101 s.
ISBN 80–224-0867–0 - FERENČÍK a kol. 2011. Imunitní systém. 2. vyd. Praha: Grada Publishing, a. s. 111–112 s.
ISBN 978–80-247–6740-6 - FERENČÍK, M. a kol. 2009. Zápal- fundamentálny princíp vzniku chorôb. 1. vyd. Balneotherma. 202 s.
ISBN 978–80-970156–1-9 - https://www.casopisvnitrnilekarstvi.cz/artkey/vnl-200607–0008_how-can-the-autoantibody-detection-help-in-the-diagnostics-and-evaluation-of-connective-tissue-diseases.php
- EUROIMMUN. Medizinische Labordiagnostika AG, 2024. IIFT : HEp-2 : Návod k použití. [príbalový leták]. Lübeck. s. 8
- EUROIMMUN. Medizinische Labordiagnostika AG, 2018. EUROLINE – Autoimunitní jaterní choroby – (IgG) : Návod na provedení testu. [príbalový leták]. Lübeck. s. 8
- CEBECAUER, L., LUPAČ, J. Standardní operační postup – SOP hodnocení obrazů fluorescence autoprotilátek na buňkách Hep-2. Praha: Dynex 2006. 84 s.
- BARTŮŇKOVÁ, J. A kol.: Vyšetřovací metódy v imunológii, Grada 2005
- MUNUJOS, PETRAKI. 2009. Immunofluorescence Patterns in Autoimmunity. Barcelona: BioSystems 2009.
60 s. - FERENČÍK, M. a spol. 2001. Imunológia- základné termíny a definície. Bratislava: Slovak Academic Press, 2001. 348 s. ISBN 80–88908-77–9
- BENČAT, M., RAJČÁNI, J. 2006 Diagnostika autoprotilátok proti antigénom bunkového jadra. Martin: Osveta. 100 s. ISBN 978–80-8063–391-2
