Referenčné intervaly (RI) sú jedným z najdôležitejších aspektov v laboratórnej diagnostike a zasluhujú veľkú pozornosť. Dnes sa na medicínske laboratóriá kladú čoraz väčšie nároky na dosahovanie vysokej metrologickej kvality laboratórnych analýz, čo je bez debaty správne, avšak musíme si uvedomiť, že bez správnej interpretácie sú tieto kvantitatívne ukazovatele bezcenné, nech sú akokoľvek presné. Výsledky laboratórnych analýz musia byť vztiahnuté k nejakej referencii a túto referenciu predstavujú RI, prípadne rozhodovacie limity.

Úvod

Podľa databázy harmonizovanej terminológie CLSI (1) sa pod pojmom RI rozumie centrálny 95-percentný interval z distribúcie referenčných hodnôt. Dnes sa ešte pomerne často stretávame s výrazom „normálne hodnoty“ alebo „norma“. Tieto výrazy nie sú vhodné pretože pôsobia mätúco. Niekto si pod tým môže predstaviť normálnu distribúciu (Gaussovské rozdelenie dát), prípadne hodnoty, ktoré zodpovedajú stavu zdravia. Prvý predpoklad nie je vždy splnený a hodnoty, ktoré ležia v oblasti „normálnych“ hodnôt, nemusia nutne vylučovať prítomnosť choroby a naopak hodnoty „abnormálne“ nemusia nutne znamenať patologický stav.

Tvorba referenčných hodnôt

Ak vychádzame z odporúčaní CLSI (2), existujú 2 cesty, ako sa dopracovať k vhodným RI:

1. tvorba RI na základe hodnôt od referenčných jedincov,
2. verifikácia už existujúcich RI.

Prvý spôsob dopracovania sa k RI je náročnejší, či už z finančného, časového alebo metodického aspektu. Tento spôsob sa dá stručne zhrnúť v tejto sekvencii. Z celkovej populácie sa vyberie referenčná populácia, ktorá spĺňa preddefinované kritériá. Z referenčnej populácie sa vyberie vzorka referenčných jedincov. Odporúčaný počet referenčných jedincov je 120 pre každú uvažovanú partíciu. U referenčných jedincov sa meraním získajú referenčné hodnoty. Referenčné hodnoty predstavujú distribúciu, z ktorej sú vypočítané referenčné limity ako 2,5. a 97,5. percentil. Spodným a horným referenčným limitom je vymedzený referenčný interval.

Druhý spôsob získania RI je o čosi reálnejší. Ide o verifikáciu už existujúcich RI (od výrobcu, iných laboratórií, štúdií a pod.). Pri tomto spôsobe potrebujete na každú uvažovanú partíciu „iba“ 20 referenčných jedincov. V prípade, že sa 18 referenčných hodnôt z 20 zmestí do verifikovaných RI, môžete považovať tieto RI za štatisticky platné.

I keď sú tieto postupy odporúčaným štandardom, ich aplikácia v praxi nie je vôbec jednoduchá. Z prvého postupu vyplývajú pre laboratórium značné prekážky. Hlavným limitujúcim faktorom je spomínaný počet referenčných jedincov. Ak odhliadneme od iných skutočnost, ako sú napríklad kvalitné zostavenie štúdie, ekonomické náklady, časová náročnosť, spracovanie dát a pod., nábor dostatočného množstva referenčných jedincov sa javí ako nedosiahnuteľná méta. Názorne to môžem ukázať na stanovení IGF-1, kde sú RI stratifikované do viac než 30 partícií a na vytvorenie vlastných RI by muselo laboratórium nabrať minimálne 3 600 referenčných jedincov. Zámerne som si vybral tento parameter, pretože je to jedno zo špecifických vyšetrení a vyšetruje ho len málo laboratórií. Ak môžem hovoriť za našu spoločnosť, v skutočnosti sa toto vyšetrenie realizuje len na jednom pracovisku. Dopyt po tomto vyšetrení sa ani len nedá porovnať s bežnými biochemickými vyšetreniami a počet meraní potrebný pre uskutočnenie stanovenia vlastných RI prekračuje ročný objem vykonaných analýz i v špecializovanom laboratóriu. Ak by ste chceli túto štúdiu vykonať a prekonali by ste všetky prekážky, z ekonomického hľadiska by to znamenalo, že po dobu dlhšiu ako 1 rok by ste realizovali vyšetrenie de facto zadarmo. Podobných príkladov by som našiel viac. Spomenuté limitácie odsudzujú tento postup na existenciu iba na papieri. Gary L. Horowitz, jeden z autorov odporúčaní (2), si je tiež vedomý náročnosti tohto postupu a podľa jeho slov by laboratóriá mali byť schopné aspoň verifikovať už existujúce RI (6). Opäť sa pozrime na stanovenie IGF-1. Ak by som chcel overiť RI od výrobcu, potreboval by som 600 referenčných jedincov. Počet potrebných probandov sa dramaticky znížil, no stále je to príliš vysoké číslo na to, aby ho dokázalo dosiahnuť jediné laboratórium. Ak by sa to predsa len podarilo, čo robiť v prípade nepriaznivého výsledky verifikácie? Laboratórium by predsa len muselo vykonať vlastnú rozsiahlu štúdiu alebo hľadať také RI, ktoré by mu „sadli“. Treba si ešte uvedomiť, že laboratóriá dnes vo svojom portfóliu ponúkajú desiatky až stovky rôznych vyšetrení v rôznych biologických tekutinách (moč, sérum, plazma, sliny, plodová voda, cerebrospinálna tekutina a pod.).

Táto úvaha nás posúva k zhodnoteniu súčasného stavu. Dovolím si tvrdiť, že málo laboratórií aplikuje vyššie popísané postupy v praxi. Skôr to ostáva v takej rovine, že si laboratóriá adoptujú RI od výrobcov IVD prostriedkov, publikácií, iných laboratórií. Podľa môjho názoru nie sú žiadne RI vyložene dobré alebo zlé. Musíme si uvedomiť, že samotné RI, aj keby skutočne odrážali referenčnú populáciu, nesú zo sebou 5-percentnú neistotu. Z koncepcie RI samotných (centrálny 95-percentný interval z distribúcie referenčných hodnôt) vyplýva, že 5 % zdravých jedincov sa bude nachádzať mimo RI.

Aké je východisko?

Mohli by sme sa inšpirovať štúdiami ako sú NORIP (5) alebo CALIPER (7). Tieto štúdie sa uskutočnili v Škandinávii, respektíve v Kanade. Zatiaľ čo prvá štúdia si dala za cieľ definovať, respektíve vytvoriť RI pre dospelú populáciu, tá druhá sa zamerala na detskú populáciu. Na týchto štúdiách participovalo, respektíve participuje (štúdia CALIPER stále prebieha) množstvo laboratórií, čo výrazne zmenšilo nároky na nábor referenčných jedincov. Viem si predstaviť, že niečo podobné by sa uskutočnilo u nás v spolupráci napríklad s Českou republikou alebo v rámci všetkých štátov V4. Bolo by veľmi dobré, ak by lokálne autority (SSKB, ČSKB, HSCP, PSLD) pomohli zostaviť spoločný plán štúdie. Myslím si, že by nebol problém nájsť laboratóriá ochotné na tomto projekte participovať.

Dovtedy si musíme, ako som už spomínal, vystačiť s údajmi:

1. výrobcov – vo väčšine prípadov nám nie sú známe všetky demografické údaje o skúmanej populácii; často nie sú zohľadnené rodové rozdiely, údaje o pediatrickej populácii absentujú,
2. štúdií – ako napríklad spomínaná štúdia NORIP; je potrebné mať na pamäti, že podobné štúdie sú zamerané na špecifickú populáciu; podmienky, za ktorých sa štúdia uskutočnila, nemusia byť podobné našim; sociálne, ekonomické a životné prostredie, genetická vybavenosť a pod. sú podľa WHO dôležitými determinantmi zdravia; použité meracie princípy môžu skomplikovať, respektíve úplne znemožniť transfer takýchto RI,
3. kníh, učebníc – neúplnosť demografických údajov, často absentuje dôležitá informácia o použitých meracích postupoch; z knižných publikácií je veľmi populárna práca od Stevena J. Soldina – dnes je k dispozícii už 7. vydanie (viď bibliografia, odkaz č. 9); oceňujem existenciu tejto práce, pretože predstavuje cennú referenciu pri riešení problematiky pediatrických RI a nemala by chýbať v žiadnom laboratóriu; často ju využívajú aj samotní lekári; veľkou výhodou je, že autor zverejňuje použité meracie aj štatistické postupy, ako aj počet jedincov, z ktorých boli RI odvodené; pri používaní tejto publikácie je potrebné si uvedomiť, že nemá univerzálne použitie a takisto je potrebné myslieť na metodologickú závislosť RI, ako aj na krajné prípady, keď boli RI odvodené z extrémne malého počtu jedincov (napr. n = 3, 8...); tieto publikované RI sú často odvodené nepriamou technikou podľa Hoffmanna, o ktorej sa ešte zmienim,
4. od iných laboratórií – pôvod RI väčšinou nie je verejne dostupný,
5. z vlastných pozorovaní v spolupráci so špecialistami – uvediem príklad z vlastnej skúsenosti; dlhý čas sme bojovali s absenciou RI pre pohlavné hormóny pre pediatrickú populáciu; pediatri boli odkázaní na RI publikované napríklad práve v spomínanej práci od Soldina; tu musím opäť pripomenúť metodologickú závislosť RI, pretože my pracujeme s inou technikou v porovnaní s tou, za pomoci ktorej boli získané hodnoty pre tvorbu v RI v tejto publikácii; tým, že sa naša spoločnosť v posledných rokoch značne rozrástla, rástla aj naša databáza pacientskych výsledkov; to nám umožnilo preskúmať a vyhodnotiť RI pre 5 pohlavných hormónov (FSH, LH, testosterón, progesterón, estradiol) u detí; výstupy zo spracovania dát sme prekonzultovali s odborníkmi na pediatrickú endokrinológiu v NEDÚ; po vzájomnej komunikácii sme sa ich rozhodli aplikovať v praxi a spätná väzba je priaznivá,
6. alebo – na tvorbu alebo verifikáciu RI možno použiť tzv. nepriame metódy; najznámejšou je Hoffmannova technika, ktorej princíp si môžete detailnejšie preštudovať v pôvodnej práci (11).

V súvislosti s nepriamou technikou stanovenia RI podľa Hoffmana ma zaujala práca od Katayeva a jeho kolegov s názvom Establishing Reference Intervals for Clinical Laboratory Test Results. Is There a Better Way? (12). Autori v práci rozoberajú odporúčané postupy stanovenia RI podľa CLSI a zamýšľajú sa, či by nepriame techniky stanovenia RI mohli pomôcť prekonať prekážky, ktoré vyplývajú z odporúčaných postupov. V tejto práci nájdete aj popis techniky podľa Hoffmanna (pozn. autora: pôvodná práca od Hoffmanna je spoplatnená, práca od Katayeva a kolegov je voľne k dispozícii). Autori preukázali na 5 analytoch (MCV, HGB, Ca, kreatinín a TSH) porovnateľnosť RI vyhodnotených nepriamou technikou s publikovanými RI. Na príklade TSH preukázali aj reprodukovateľnosť tejto metódy, čo by mal byť základný predpoklad postupu pre stanovenie RI. Táto práca pripútala aj pozornosť Gary L. Horowitza (6). Práca Katayeva zaujala aj ďalšieho pána menom Dorizzi (13), ktorý sa rozhodol do diskusie pripojiť a potvrdil výsledky Katayeva. Keďže v týchto prácach boli analyzované výsledky TSH namerané na analyzátore Siemens Advia Centaur, ktorým disponujeme aj v našej spoločnosti, rozhodol som sa overiť tieto tvrdenia vo vlastných podmienkach. Navyše, TSH je náročný analyt z pohľadu distribúcie výsledkov, ktorá je pozitívne zošikmená.

Materiály a metódy k tvorbe RI pre TSH

Pacientske výsledky

Na experiment boli použité výsledky TSH dospelých mužov a žien vo veku 18 – 90 rokov uložené v databáze pacientskych výsledkov spoločnosti Alpha medical za obdobie 1. 4. – 16. 9. 2014. Výsledky TSH boli stanovené na základe indikácie ošetrujúcimi lekármi. Z databázy boli selektívne extrahované výsledky TSH stanovené v 3 centrálnych laboratóriách spoločnosti Alpha medical – pre východoslovenský kraj (Stropkov), stredoslovenský kraj (Ružomberok), Bratislavu a zo satelitného laboratória v Ľubochni. Toto satelitné laboratórium je pracoviskom, ktoré slúži aj potrebám NEDÚ v Ľubochni. NEDÚ sa špecializuje hlavne na endokrinologické poruchy, kde veľkú časť prípadov (70 %) (4) predstavujú poruchy funkcie štítnej žľazy (ŠŽ).

Z dôvodu tejto veľkej prevalencie porúch ŠŽ bolo pre mňa zaujímavé, ako si nepriama technika odvodenia RI podľa Hoffmanna poradí s touto špecifickou populáciou, ktorá sa v NEDÚ diagnostikuje. V poslednom kroku som spojil databázy výsledkov TSH z centrálnych laboratórií (ST/RK/BA). Charakteristiky skúmaných populácií, bez akýchkoľvek úprav, sú zhrnuté v Tabuľke č. 1. V Tabuľke č. 2 sú uvedené relatívne početnosti indikácií vyšetrenia TSH podľa odbornosti v jednotlivých regiónoch.

Technické vybavenie

Všetky zúčastnené pracoviská použili na stanovenie TSH prístroj ADVIA CENTAUR XP od firmy Siemens. Výsledky TSH boli stanovené 3. generáciou ultrasenzitívnych reagencií (TSH3-UL, REF 06491080). Všetky zúčastnené pracoviská sú držiteľmi osvedčenia o akreditácii podľa STN EN ISO 15189 a stanovenie TSH spadá do rozsahu akreditácie.

Štatistická analýza

Na vyhodnotenie dát bol použitý MedCalc Statistical Software version 13.1.2 (MedCalc Software bvba, Ostend, Belgium; http://www.medcalc.org) a Microsoft Excel (2013). Deskriptívne štatistiky uvedené v Tabuľke č. 1 boli vyhodnotené zo surovej databázy, t. j. bez akejkoľvek úpravy. Pred aplikáciou Hoffmannovej techniky boli všetky dáta podrobené testovaniu a odstráneniu odľahlých hodnôt pomocou Chauvenet kritéria. Po odstránení odľahlých hodnôt boli dáta vizualizované pomocou grafov relatívnych kumulatívnych početností a identifikované príslušné oblasti linearity. Pomocou rovníc lineárnych regresií (y = a + bx) boli lineárne oblasti aproximované do oblasti 2,5. a 97,5. percentilu a vypočítané limity RI (pre 2,5. percentil x = 2,5; pre 97,5. percentil x = 97,5). Pomocou koncepcie RCV (Reference Change Value) (17) som porovnal vypočítané RI s rôznymi referenciami (viď Tabuľka č. 4). Pre výpočet RCV boli použité údaje o individuálnej biologickej variácii TSH (18) (CVw = 19,3 %) a analytickej precíznosti stanovenia TSH na základe ročných výsledkov IQC z prevádzky klinickej biochémie v Ľubochni (CVa = 2,69 %). CVa odráža precíznosť stanovenia na úrovni koncentrácie TSH približne 0,40 a 5,0 mIU/l. Bol použitý priemerný údaj CVa, keďže rozdiely v CVa na hladine 0,40 a 5,00 mIU/l boli nevýznamné. RCV pre TSH = 54,01 %.

Výsledky

Diskusia

Vypočítané RI pre TSH z rôznych súborov dát boli vo veľmi dobrej zhode s viacerými referenciami (viď Tabuľka č. 4). Spodné medze RI pre súbory dát z pracovísk BA a RK boli vzhľadom na spodnú medzu 0,4 mIU/l, ktorá je spomínaná v odporúčaniach ETA z roku 2013 (15), vyššie o 55 %, respektíve 62,5 %, čo je podľa konceptu RCV významná diferencia. Podľa ETA je RI pre TSH pre dospelú populáciu medzi 0,4 – 4,0 mIU/l (z textu odporúčaní ETA z 2013 mi nie je zrejmý pôvod tohto údaju). Podľa odporúčaní AACE a ATA je RI pre TSH pre dospelú populáciu 0,45 – 4,12 mIU/l (údaj zo štúdie NHANES III). Pri porovnaní vypočítaných RI s týmto údajom diferencie nenadobúdajú významnosť, ako je zrejmé z Tabuľky č. 4, RI pre TSH vyhodnotené v laboratóriu v Ľubochni (NEDÚ) nie sú kompatibilné v porovnaní so žiadnou referenciou. Problematická ja hlavne spodná medza RI. Horná medza je naopak porovnateľná naprieč rôznymi referenciami. Tieto výsledky však boli očakávané, keďže v laboratóriu klinickej biochémie v Ľubochni sa vyšetruje špecifická populácia pacientov, z ktorých prevažná väčšina trpí endokrinologickým ochorením – z toho 70 % tvoria práve poruchy štítnej žľazy. Toto pozorovanie poukazuje na možnú slabinu tejto techniky (14). Šírka vypočítaných RI (viď Tabuľka č. 4, údaj CV) bola porovnateľná s tými, ktoré boli vyhodnotené nepriamou alebo priamou technikou. V porovnaní s RI uvádzaných v odporúčaniach ETA, AACE a ATA sú užšie a v porovnaní s RI, ktoré boli získané od referenčných jedincov tou istou metódou stanovenia (Reix), sú mierne širšie. RI vypočítané zo súboru chorých pacientov (LU) boli najširšie.

Záver

Nepriama technika odvodenia RI pre TSH či už v tejto práci alebo iných (12, 13), je v dobrej zhode s odporúčaným štandardom (15, 16, 18). Na príklade stanovenia TSH bola preukázaná spoľahlivosť, ako aj reprodukovateľnosť tejto metódy. Je teda nepriama metóda podľa Hoffmana dobrou alternatívou pre odporúčané postupy? V mojich očiach áno. Samozrejme, táto metóda nebude mať univerzálne a priamočiare použitie. Jednou zo slabín, nakoniec som na to poukázal v tejto práci, je skladba populácie, ktorá sa v danom laboratóriu vyšetruje. Bolo by nelogické, aby som vyhodnocoval referenčné intervaly z výsledkov laboratória, ktoré analyzuje vzorky krvi pre špecializované zdravotnícke zariadenia a kde je výskyt určitej choroby vysoko prevalentný. V našom prípade išlo o vyšetrenie TSH a ochorenia štítnej žľazy v Ľubochni. Rovnako by nebolo vhodné, aby sa napríklad RI pre kreatinín stanovovali z výsledkov pacientov, ktorí podstupujú dialýzu. Znalosť vyšetrovanej populácie pacientov nám preto pomôže pri rozhodovaní o použití tejto metódy v určitých situáciách. Spoľahlivosť nepriamej techniky sa dá zvýšiť v kombinácii s ostatnými informáciami, ktoré sú bežne ukladané v databáze LIS (20). Na základe diagnóz, výsledkov iných vyšetrení, antropometrických údajov a pod. sa tak môžu vytvoriť kritériá pre inklúziu a exklúziu jedincov. Vhodná je tiež komunikácia a spolupráca s lekármi, ktorí využívajú služby laboratória. Pre aplikáciu tejto techniky je potrebný väčší počet meraní, najlepšie tisíce až desaťtisíce výsledkov. Platí čím viac, tým lepšie.

---

Literatúra a skratky:

1. http://login.clsi.org/HTDatabase.cfm
2. Clinical and laboratory standards institute. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory; Approved guideline. Third edition. CLSI document C28 – A3. Wayne, PA: Clinical and laboratory standards institute; 2008.
3. http://www.who.sk/
4. http://www.nedu.sk/
5. RustadP et al. The Nordic Reference Interval Project 2000: recommended reference intervals fo 25 common biochemical properties. Scand J ClinInvets 2004; 64: 271 – 284
6. Horowitz GL. Estimating reference intervals. Am J ClinPathol 2010; 133: 175 – 177
7. http://www.caliperproject.ca
8. http://www.who.int/hia/evidence/doh/en/
9. http://direct.aacc.org/ProductCatalog/Product.aspx?ID=6116
10. https://www.westgard.com/biodatabase1.htm
11. Hoffmann RG. Statistics in the practice of medicine. JAMA 1963; 185: 864 – 873
12. Katayev et al. Establishing reference Intervals for clinical laboratory test results. Is there a better way? Am J ClinPathol2010; 133: 180 – 186
13. Dorizzi et al. Indirect methods for TSH reference interval: At last fit for purpose? Am J ClinPathol2011; 135: 167 – 174
14. Solber HE. Using a hospitalized population to establish reference intervals: pros and cons. ClinChem 1994; 40: 2205 – 2206
15. Pearce Simon HS et al. 2013 ETA Guideline: Managment of subclinical hypothyroidism.Eur Thyroid J 2013; 2: 215 – 228
16. Reix N et al. Thyroid-stimulating hormone and free thyroxine on the ADVIA Centaur immunoassay system: a multicenter assessment of anayltical performance. ClinBiochem 2013; 46: 1305 – 130
17. Fraser G. Biological Variation: From Principles to practice. AACC Press 2001
18. http://www.westgard.com/biodatabase1.htm
19. Garber JR et al. Clinical practise guidelines for hypothyroidism in adults: cosponsored by the american association of clinical endocrinologist and the american thyroid association. Thyroid 2012; 22; 1200 – 1235
20. Kouri T et al. Reference intervals developed from data for hospitalized patients: computerized method based on combination of laboratory and diagnostic data. ClinChem 1994; 40: 2209 – 2215

AACE	American Association of Clinical Endocrinologists
ATA	American Thyroid Associaiton
CLSI	Clinical and Laboratory Standards Institute
CVa	analytický koeficient variácie
CVw	intraindivudálna biologická variabilita
ETA	European Thyroid Association
HSCP	Hungarian Society of Clinical Pathology
IGF-1	Insulin growth factor 1
IVD	In vitro diagnostické prostriedky
LIS	Laboratórny informačný systém
NEDÚ	Národný endokrinologický a diabetologický ústav, nezisková organizácia
NHANES III	National Health and Nutrition Examinations Survey III
PSLD	Polish Society for Laboratory Diagnostics
RI	referenčný interval, referenčné intervaly
V4	Vyšehradská štvorka
WHO	World Health Organisation