V posledných dvoch dekádach zažíva genetická klinická a laboratórna diagnostika dynamický rozvoj, ktorý zásadne mení spôsob identifikácie a interpretácie geneticky podmienených ochorení. Medzi najvýraznejšie súčasné trendy patrí využívanie celoexómového sekvenovania (WES, z angl. whole exome sequencing) a umelej inteligencie (AI, z angl. artificial intelligence), ktoré výrazne urýchľujú diagnostický proces a zvyšujú jeho presnosť. WES umožňuje komplexný pohľad na genetickú výbavu pacienta so zameraním na jej oblasti kódujúce proteíny, zatiaľ čo AI prispieva k efektívnejšiemu vyhodnoteniu takto získaných genetických dát s cieľom identifikovať príčiny dedičných ochorení.
Poskytovanie zdravotnej starostlivosti v lekárskej genetike
Genetická diagnostika je v dnešnej dobe neoddeliteľnou súčasťou bežnej zdravotnej starostlivosti. Prakticky každá špecializácia využíva genetickú diagnostiku, požiadavky stále rastú. Zároveň aj samotný odbor lekárskej genetiky mení svoje postupy, ktoré využíva. Nové metódy sa zavádzajú rýchlo a často, cieľom je čo najpresnejšia diagnostika čo najväčšieho počtu pacientov.
Pracoviská lekárskej genetiky rozdeľujeme na dve skupiny. Ide o ambulancie lekárskej genetiky, ktoré patria do špecializovanej ambulantnej starostlivosti a laboratóriá lekárskej genetiky, ktoré patria medzi spoločné vyšetrovacie a liečebné zložky.
Súčasná prax na ambulancii lekárskej genetiky
Cesta pacienta v rámci genetickej diagnostiky začína odoslaním pacienta na ambulanciu lekárskej genetiky. Okrem niekoľkých výnimiek ide o najčastejší prístup k diagnostike. Dôvodom odoslania je podozrenie na genetickú diagnózu u pacienta, znalosť diagnózy umožňuje lepšiu a kvalitnejšiu starostlivosť, časť terapie je dokonca podmienená výsledkom genetického vyšetrenia. Najčastejšími špecialistami, ktorí odosielajú pacientov na genetické vyšetrenie, sú pediatri a pediatrické subšpecializácie, klinickí onkológovia, neurológovia, gynekológovia. Spomínanou výnimkou je niekoľko vyšetrení, ktoré je možné indikovať priamo špecialistami, ide zväčša o jednoduché vyšetrenia s jasnou koreláciou genotypu a fenotypu, napríklad analýza Gilbertovho syndrómu, laktózovej intolerancie, stanovenie predispozície k trombofilným stavom a iné.
Odoslanie pacienta na ambulanciu lekárskej genetiky má svoje špecifiká. Pacient nemusí prísť nalačno, aj v prípade odberov na laboratórne vyšetrenia to nie je prekážkou. Na prvé vyšetrenie je vhodné priniesť čo najviac zdravotnej dokumentácie, ideálne priamo nálezy alebo výpisy zo zdravotnej dokumentácie.
Prvým krokom ambulantného vyšetrenia je podrobná analýza rodokmeňa pacienta. S pacientom sa pokúsime získať minimálne trojgeneračný rodokmeň, pýtame sa na závažné ochorenia v rodine, hlavne v mladšom veku, na predčasné úmrtia, mŕtvonarodené deti, opakované potraty. Z ochorení nás zaujímajú mentálne postihnutia, onkologické diagnózy, závažné, zriedkavejšie diagnózy z detstva a v dospelosti približne do 50 roku života. Ak to okolnosti dovolia, hlavne závažné diagnózy je dobré potvrdiť zdravotnými nálezmi, pitevnou správou, výpisom zo zdravotnej dokumentácie.
Ďalším krokom je fyzikálne vyšetrenie pacienta. Toto vyšetrenie sa týka väčšiny pacientov, výnimkou bývajú väčšinou tehotné pacientky. Vyšetrenia sú zamerané na známky a príznaky genetických ochorení. Súčasťou vyšetrenia je aj antropometrické vyšetrenie, minimálne v rozsahu výšky, hmotnosti a obvodu hlavy, hlavne v prípade detského pacienta. Posledným krokom ambulantného vyšetrenia je analýza zdravotnej dokumentácie pacienta. V prípade operačných zákrokov a biopsií nás zaujíma histologické vyšetrenie, cenné sú správy z hospitalizácií a nálezy z konziliárnych vyšetrení.
Celý popísaný postup vstupného ambulantného vyšetrenia vedie lekára genetika k rozhodnutiu, či je u pacienta reálne podozrenie na genetické ochorenie. Ak je odpoveďou áno, ďalším krokom je rozhodnutie, aký typ genetického laboratórneho vyšetrenia je v tejto situácii optimálny. Teoreticky je jediným kritériom pre voľbu vyšetrenia zdravotný benefit pacienta, ale žijeme v reálnom svete a limitom je aj dostupnosť vyšetrenia zo strany poskytovateľov a možnosti a limity zdravotnej poisťovne pacienta.
Genetické laboratórne vyšetrenia môžeme rozdeliť do niekoľkých skupín. V prvej skupine je základné cytogenetické vyšetrenie, analýza karyotypu a FISH vyšetrenia (z angl. fluorescence in situ hybridization, fluorescenčná in situ hybridizácia), ktoré sa často používajú na spresnenie karyotypu alebo v rámci onkogenetiky. V ďalšej skupine je analýza známej mutácie niektorého z génov. Tieto vyšetrenia nepredstavujú problém z hľadiska indikácií, laboratórií alebo zdravotných poisťovní. Potom máme vyšetrenia, ktorých realizácia závisí od možností poskytovateľov a od podmienok stanovených zdravotnými poisťovňami. Tu patrí analýza konkrétneho génu, array analýza zameraná na delécie a duplikácie chromozómov a nové, moderné analýzy na podklade masívneho paralelného sekvenovania – panelové analýzy, CES (z angl. clinical exome sequencing, sekvenovanie klinického exómu), WES. V prípade týchto vyšetrení zdravotné poisťovne často aplikujú tzv. predschvaľovanie. Lekár genetik požiada zdravotnú poisťovňu pacienta o schválenie úhrady vyšetrenia a podľa rozhodnutia zdravotnej poisťovne sa vyšetrenie realizuje alebo nerealizuje.
Súčasná prax v laboratóriu lekárskej genetiky
Ako bolo spomenuté, od lekárskeho genetika putuje vzorka pacienta do laboratória lekárskej genetiky. Podľa typu žiadaného vyšetrenia ide o vzorku periférnej krvi alebo plodovej vody, v prípade potreby však vieme spracovať aj vstupný materiál ako tkanivo, bukálny ster a podobne. Pri požiadavke o cytogenetické vyšetrenie sa vzorka v prvom kroku kultivuje a následne analyzuje prostredníctvom zobrazenia v mikroskope, prevažnú väčšinu prijatých požiadaviek však predstavujú vzorky určené na molekulárno-genetické vyšetrenie, keď je základným krokom ich spracovania izolácia DNA (z angl. deoxyribonucleic acid, deoxyribonukleová kyselina).
Práve molekulárno-genetická diagnostika prešla za posledné dve desaťročia pozoruhodným pokrokom, ktorý zásadne zmenil naše chápanie genetických mechanizmov podieľajúcich sa na rôznych patologických procesoch v ľudskom organizme, vďaka čomu neustále pribúdajú známe geneticky podmienené zriedkavé ochorenia (1). Súbežne s technologickým pokrokom sa rozširuje odborné aj laické povedomie o možnostiach genetického testovania a v tejto kombinácii pochopiteľne narastá potreba jeho využitia so zámerom rýchlo a presne diagnostikovať klinický stav konkrétnych pacientov. Znalosť presnej diagnózy má totižto veľakrát zásadný vplyv na ich životy v zmysle manažmentu ochorenia, v určitých prípadoch nastavenia vhodnej liečby, poradenstva v rámci rodiny a plánovania potomstva. Významná je aj psychologická stránka, keď sa získaním finálnej diagnózy pacientovi ukončí diagnostická púť, ktorá môže do tohto bodu trvať aj roky a byť značne frustrujúca.
Revolúciu v analýze DNA priniesla metóda NGS (z angl. next-generation sequencing, sekvenovanie novej generácie), ktorá sa vyznačuje schopnosťou simultánne identifikovať varianty naprieč viacerými génmi, čo vedie k nákladovej efektívnosti a vysokému diagnostickému výnosu, a to najmä pri ochoreniach charakterizovaných genetickou heterogenitou (2). Aplikácie NGS sú rôznorodé a neustále sa rozširujú, v našich laboratóriách ho využívame v oblasti onkogenetiky a v diagnostike germinálne podmienených zriedkavých ochorení. Aby sme držali krok s dobou a dokázali našim pacientom ponúknuť tie najlepšie možnosti genetickej diagnostiky, do laboratória lekárskej genetiky v Bratislave sme v priebehu minulého roku zakúpili moderný vysokokapacitný prístroj NovaSeq 6000Dx (3). Metódou NGS, konkrétne prístupom WES, sme na tomto prístroji aktuálne schopní analyzovať jednotlivé gény, panely génov až celý exóm pacienta. V prípade analýzy exómu ide v preklade o sekvenčný prístup, ktorý sa zameriava na oblasti génov kódujúce proteíny. Hoci exóm predstavuje približne len 2 % celého genómu, obsahuje väčšinu známych variantov spôsobujúcich ochorenia.
Mať skvelý prístroj však samo o sebe pre kvalitný výsledok nestačí. Primárnym predpokladom je motivovaný a kvalifikovaný personál, ktorý k vzorkám a dátam pacientov pristupuje maximálne zodpovedne. Krok vyhodnotenia NGS dát je v celom procese tvorby laboratórneho výstupu kľúčový. Laboratórny diagnostik sa venuje každému pacientovi zvlášť, čo môže trvať rôzne dlho – v závislosti od rozsahu požadovaného vyšetrenia a konkrétneho nálezu u daného pacienta. V procese diagnostiky pracujeme s odbornými zdrojmi z medzinárodných databáz, kde vyhľadávame údaje o už zaznamenaných variantoch, ďalej z databáz genetických ochorení, pomocou ktorých korelujeme nález s klinikou pacienta a z vedeckých a klinických publikácií, vďaka ktorým dokážeme lekárovi poskytnúť prepojenie na podobné, už popísané prípady zhodujúce sa s jeho pacientom. Tieto zdroje nám umožňujú nález klasifikovať a následne interpretovať vo forme výsledkovej správy.
Hoci to všetko znie celkom jasne, realita je taká, že so zvyšujúcou sa komplexnosťou testovania sa objavuje aj nová výzva – získavame obrovské množstvo dát, ktoré je náročné na spracovanie a zároveň narastá počet nejednoznačných nálezov, tzv. variantov nejasného významu (VUS, z angl. variant of uncertain significance) (4). Výsledok v podobe VUS môže byť sklamaním, pretože pre lekára a pacienta väčšinou neposkytuje použiteľnú odpoveď. Zároveň, náročnosť interpretácie rozsiahlych dát generovaných z WES si vyžaduje sofistikovanejšie analytické nástroje v podobe značných výpočtových zdrojov a bioinformatickej odbornosti. Ani v tejto oblasti však pokrok nezaostáva a flexibilita a prístupnosť bioinformatickej analýzy je značne dostupnejšia aj pre diagnostické účely.
V smere bioinformatického spracovania NGS dát sa kľúčovým nástrojom stala AI, ktorá transformuje spôsob, akým sa tieto dáta analyzujú a interpretujú (5). Jej schopnosť spracovávať ich obrovské množstvá a prepájať súvislosti, ktoré by človeku zabrali množstvo času a sústredenia, má významný vplyv na klinickú prax. AI nám pomáha od triedenia obrovského množstva dát cez porovnávanie dát pacienta s rozsiahlymi medicínskymi databázami až po identifikáciu chýb sekvenovania. V našich genetických laboratóriách aktuálne používame vyhodnocovací softvér Emedgene, ktorý využíva vysvetliteľnú AI (XAI, z angl. explainable artificial intelligence) (6). XAI poskytuje vysokú presnosť v prioritizácii relevantných nálezov a transparentnú logiku tohto procesu, ktorá je podložená odbornou literatúrou a databázovými zdrojmi.
Množstvo dát a neurčitých nálezov však skrýva aj jedno pozitívum, a to aspekt potenciálneho dlhodobého prínosu z hľadiska budúcej využiteľnosti týchto dát, keďže s odstupom času sa v dôsledku pribúdajúceho odborného poznania môže preukázať nová alebo jednoznačnejšia asociácia s konkrétnym ochorením. Táto schopnosť umožňuje neustále zlepšovanie diagnostického výnosu bez potreby opakovania „mokrého“ laboratórneho procesu, čo robí WES vysoko cenným dlhodobým aktívom pre starostlivosť o pacientov a výskum, najmä pre reklasifikáciu VUS.
Technologický posun smerom ku komplexným a robustným metódam, ako je NGS, však stále neznamená úplnú náhradu tradičných testov, ale skôr ich integrovanie do širších diagnostických stratégií. Popri NGS naše diagnostické genetické laboratóriá stále potrebujú a ponúkajú rôznorodé spektrum metód a klinickí genetici volia testy na základe špecifických indikácií, rozsahu detekcie, času obratu a nákladov. Tradičné metódy si tak zachovávajú svoje špecifické úlohy, najmä pre cielené analýzy, kde ich nákladová efektívnosť alebo rýchlosť môžu byť výhodnejšie.
Trendy na ambulancii lekárskej genetiky
V posledných rokoch vidíme posun v spôsobe manažmentu pacientov v ambulancii lekárskej genetiky. Klesá počet pacientov, u ktorých sa cielene indikuje analýza jedného génu, okrem špecifických prípadov sa takéto vyšetrenia neukázali ako veľmi efektívne. Omnoho viac sa využívajú analýzy na podklade CES (asi 4 000 – 6 000 génov) a WES (asi 20 000 génov), keď sa naraz vyšetrí veľké množstvo génov podľa konkrétneho fenotypu – napríklad kardiomyopatia, neuropatia, hereditárne nádorové syndrómy a pod. Tieto vyšetrenia sú omnoho úspešnejšie, v závislosti od konkrétnej situácie je úspešnosť vyšetrení 30 – 80 %. O kvalite vyšetrenia rozhoduje viacero faktorov. Na začiatku je kvalitný popis fenotypu na ambulancii, pri laboratórnej časti je dôležité používanie aktualizovaného softvéru s prepojením na databázy a dobré nastavenie filtrácie variantov. Tieto multigénové analýzy vyžadujú intenzívnejšiu spoluprácu medzi ambulanciou a laboratóriom. Okrem prípadov, ktoré stanovia príčinu ochorenia pomerne jednoznačne, máme situácie, keď laboratórium reportuje viacero variantov nejasného významu, s ktorými treba ďalej pracovať. Časť tejto práce je možné realizovať v rámci štandardného poskytovania zdravotnej starostlivosti, výsledkom býva spresnenie nálezu a ďalší dodiagnostikovaní pacienti. Najčastejšie sa využíva segregačná analýza a využitie negenetických diagnostických postupov.
Trendy v laboratóriu lekárskej genetiky
Historicky začínali genetické laboratóriá Unilabs (v začiatkoch Gendiagnostica, následne Alpha medical) s metódami ako PCR (z angl. polymerase chain reaction, polymerázová reťazová reakcia), gélová elektroforéza, karyotypová analýza, Sangerove sekvenovanie, fragmentačné analýzy a MLPA (z angl. multiplex ligation-dependent probe amplification, multiplexná amplifikácia sond závislá od ligácie). V priebehu rokov a našej diagnostickej praxe sme rozšírili paletu ponúkaných vyšetrení aj o FISH, SNP microarray (z angl. single nucleotide polymorphism, jednonukleotidový polymorfizmus) a NGS.
Ak sa pozrieme spätne práve na metódy s ktorými sme začínali, tieto boli v mnohých prípadoch pomalé a nákladné, pričom väčšine pacientov nepriniesli jednoznačnú odpoveď na otázku ohľadom príčiny ich ochorenia – všetky tieto aspekty obmedzovali ich dlhodobé široké uplatnenie. Celý molekulárno-genetický diagnostický svet hodnotí prechod od tradičných metód – ako je Sangerove sekvenovanie, k robustnejším technológiám, ako je NGS – ako revolučný. Nástup NGS priniesol zásadnú zmenu, ktorá ponúka nové možnosti analýzy molekúl DNA a RNA (z angl. ribonucleic acid, ribonukleová kyselina) s vysokou priepustnosťou a nákladovou efektívnosťou. Táto zmena umožnila rýchle a presné sekvenovanie až na úroveň celých genómov, čo vedie k hlbšiemu pochopeniu genetických zmien a identifikácii ďalších patogénnych variantov spôsobujúcich ochorenia.
Techniky NGS, ako sú cielené sekvenovanie, WES a WGS (z angl. whole genome sequencing, sekvenovanie celého genómu), umožňujú hĺbkovú analýzu DNA. Nami aktuálne využívané WES má napriek svojim výhodám aj určité obmedzenia, pričom tým hlavným je už spomenuté, že skúma iba oblasti kódujúce proteíny. To znamená, že môže prehliadnuť dôležité varianty mimo exómu, najmä v regulačných oblastiach, ktoré sú kritické pre génovú expresiu. WGS, naopak, poskytuje komplexnejší pohľad vrátane nekódujúcich oblastí a štrukturálnych variantov. WES je v podstate cielenou podmnožinou WGS a teoreticky tak WGS predstavuje ďalšiu métu, kam by sa možnosti našej diagnostiky mohli v budúcnosti uberať.
Zahraničné vedecké a diagnostické pracoviská nás inšpirujú tiež prístupmi, ako sú NGS s dlhými čítaniami (angl. long-read sequencing), single-cell NGS, kvapalná biopsia, diagnostika za použitia CRISPR (z angl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) a podobne (7). V našich podmienkach sa využitie niektorých z nich v povedomí odbornej klinickej spoločnosti ešte len musí etablovať a zároveň im musí byť otvorený aj náš verejný zdravotný systém. Aj keď sú mnohé zahraničné laboratóriá vždy o krok pred nami, naši pacienti dostávajú adekvátnu a erudovanú zdravotnú starostlivosť. Naše diagnostické skúsenosti, moderné prístrojové vybavenie a spolupráca s overenými dodávateľmi ponúkajú na slovenskom trhu záruku kvality.
Záver
Oblasť genetickej diagnostiky prešla v uplynulých rokoch transformačným obdobím, ktoré bolo a stále je podmienené značným technologickým pokrokom. Tento pokrok nás priviedol k rýchlejšiemu a cenovo dostupnejšiemu genetickému testovaniu, ktoré sa tak stalo neoddeliteľnou súčasťou klinickej praxe. Kľúčovými hnacími silami tejto revolúcie sú NGS, najmä WES, a rýchlo sa rozvíjajúca oblasť AI. Nákladová efektívnosť WES a schopnosť reanalyzovať dáta s novými poznatkami z neho robia cenný dlhodobý prínos. AI je zásadná pre túto evolúciu, keďže jej algoritmy dramaticky zvyšujú rýchlosť a presnosť analýzy NGS dát.
Čo však na záver treba zdôrazniť, za všetkými týmito pokrokmi stojí iniciatíva pomôcť konkrétnym pacientom, ktorí by sa bez možnosti genetickej diagnostiky nikdy nemuseli dočkať svojej definitívnej diagnózy. A napriek všetkým spomínaným pokrokom a účasti AI, skúsenosť a odbornosť lekárskeho genetika či laboratórneho diagnostika je stále kľúčová. Úplne nenahraditeľná je najmä komunikácia medzi pacientom a lekárom a následne spolupráca medzi lekárom a diagnostikom, bez čoho by sme potenciál týchto vymožeností nevedeli využiť.
Literatúra
- Simarro F S. Advances in clinical genetics and its current challenges. An Pediatr (Engl Ed). 2022 Oct;97(4):281.e1-281.e5.
- Yadav D et al. Next-Generation sequencing transforming clinical practice and precision medicine. Clin Chim Acta. 2023 Nov 1:551:117568.
- Modi A et al. The Illumina Sequencing Protocol and the NovaSeq 6000 System. Methods Mol Biol. 2021:2242:15-42.
- Fowler D M. Will variants of uncertain significance still exist in 2030? Am J Hum Genet. 2024 Jan 4;111(1):5-10.
- Doung D, Solomon B D. Artificial intelligence in clinical genetics. Eur J Hum Genet. 2025 Mar;33(3):281-288
- Kašný M et al. Rapídne celogenómové sekvenovanie a komplexná analýza s využitím AI Emedgene. Lek. genet. diagn. 2024;1(2):131-134.
- Rolando J C et al. The Present and Future Landscapes of Molecular Diagnostics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 2024;17(1):459-474.
