Patológia je veda – náuka o chorobe. Tvorí akýsi pomyslený most medzi vedou a medicínou. Podporuje každý aspekt starostlivosti o pacienta, od stanovenia diagnózy ochorenia, kritérií liečebného postupu až po aplikáciu špičkových genetických technológií v predikcii a prevencii chorôb.

Úvod

Vo svete diagnostickej (bioptickej) „anatomickej“ patológie sa toho v posledných rokoch veľa zmenilo, ale veľa sa toho aj nezmenilo.
Čo sa nezmenilo, je základ diagnostiky v bioptickej patológii. Týmto základom bolo historicky hrubé (makroskopické) vyšetrenie tkanív a mikroskopické vyšetrenie tkanivových rezov a buniek zafarbených hematoxylínom a eozínom, ktoré boli získané z biopsií a chirurgických resekcií. Tieto prístupy dominujú vo svete diagnostickej bioptickej patológie naďalej a majú takú silu, že sa pravdepodobne budú používať ako diagnostické nástroje aj v budúcnosti.

Klinické aspekty patológie

To, čo sa v tejto ére molekulárnej medicíny zmenilo, je, že paleta diagnostických nástrojov patológa sa rozšírila o techniky, ktoré umožňujú diagnostickú charakterizáciu chorobných procesov na molekulárnej úrovni. Cielená identifikácia špecifických molekúl na diagnostiku sa v skutočnosti začala v 80. rokoch 20. storočia s príchodom diagnostickej imunohistochémie. Táto technika umožňuje simultánne vizualizovať bunkový typ a diferenciačné markery v štandardných tkanivových rezoch svetelnou mikroskopiou a spôsobila revolúciu v bioptickej patológii.

Je nenahraditeľná pri diagnostickej typizácii nádorov, dokonca aj pri biopsiách malých rozmerov, ako aj pri materiáloch odobratých hrubou ihlou (core cut). Je nenahraditeľná aj pri diagnostických postupoch, ktorých úlohou je stanovenie biologickej povahy lézie, ako aj základné stagingové kritériá ako napríklad penetrácia novotvaru do okolia alebo lymfovaskulárna propagácia.

Diagnostické nástroje molekulárnej genetickej patológie boli pôvodne použiteľné iba na čerstvé alebo zmrazené bunky a tkanivá, ale dnes sa už bežne používajú na tkanivách fixovaných vo formalíne a zaliatych do parafínu, čo je bežný stav bioptických a resekčných tkanív dostupných na analýzu. Diagnostika molekulárnej patológie mala veľký vplyv na diagnostiku mnohých druhov nádorov. Napríklad klasifikácia mnohých leukémií a lymfómov podľa Svetovej zdravotníckej organizácie je založená na kombinácii svetelno-mikroskopických znakov (morfológie), imunofenotypu a molekulárnej genetiky.

Diagnostická anatomická patológia ako špecializácia v medicíne zahŕňa prax všeobecnej bioptickej patológie, cytopatológie a pitevnej patológie.

Pre mnohé nenádorové ochorenia a väčšinu solídnych nádorov je svetelná mikroskopia stále zlatým štandardom. Svetelný mikroskop je základným pracovným nástrojom patológa. Všetky pracovné postupy spracovania bioptického a cytologického materiálu majú za úlohu umožniť vyšetrovanie tkanív a buniek vo svetelnom mikroskope. S nástupom digitalizácie dôjde aj k zmene pracovného nástroja, čo v praxi bude znamenať náhradu okulárov mikroskopu monitorom počítača. Svetelný mikroskop v zmysle prenosu obrazu nahradí digitálny scanner. Hovorí sa tomu dnes nie celkom správne „digitálna patológia“, čo však nie je presné označenie, lebo ide len o zmenu pracovného prostredia – rovnako ako k tomu došlo v rádiodiagnostike, kde tiež došlo k digitalizácii obrazu a klasické snímky nahradil monitor počítača. A nehovoríme tomu digitálna rádiodiagnostika (aj keď tá by mala k tomuto názvu bližšie). Všetky pracovné postupy ale ostanú zachované. A v zálohe aj svetelný mikroskop…

Molekulárna patológia je a aj bude čoraz užitočnejšia už nielen v zložitých diagnostických prípadoch, ale hlavne pri stratifikácii rizika pacientov a pri predikcii odpovede na špecifické terapie. Už dnes sa menia klasifikácie nádorov podľa molekulárnych parametrov a odpovede na liečbu.

Vlastnosti nádorov

Správanie nádoru, hlavne jeho agresívne správanie, je dané vlastnosťami ako: schopnosť prerastať do okolitých tkanív a orgánov, schopnosť šíriť sa krvnou alebo lymfatickou cestou, rýchlosť množenia nádorových buniek atď.

Jednotlivé nádory sa líšia nielen medzi sebou navzájom, tzv. intertumorálna heterogenita, ale aj vlastnosťami medzi jednotlivými nádorovými bunkami v tom istom nádore, tzv. intratumorálna heterogenita. Vlastnosti nádorov sú charakterizované aj plasticitou, takže môžu reagovať na vonkajšie aj vnútorné podnety a tým sa prispôsobovať, teda meniť svoje vlastnosti. A práve spomínané dve charakteristiky – intratumorálna heterogenita a plasticita – do veľkej miery ovplyvňujú agresívne správanie nádoru.

Nádor je heterogénne zoskupenie buniek s rozdielnymi vlastnosťami. Tieto vlastnosti sa môžu meniť aj v dôsledku interakcie buniek s mikroprostredím nádoru alebo vzájomnej interakcie buniek novotvaru.

Táto heterogenita môže viesť k agresivite nádorov a náročnejšej liečbe. Pochopenie molekulárnych a bunkových mechanizmov heterogenity nádorov, ktoré sú relevantné pre vývoj rezistencie na liečbu, predstavuje hlavnú oblasť výskumu nádorov, ale aj nástrojov molekulárnej patológie.

V dôsledku nádorovej heterogenity a plasticity sa do popredia dostal koncept tzv. personalizovanej terapie (medicíny), ktorý vychádza zo skutočnosti, že neexistujú dvaja pacienti s identickým nádorom. Podstatou personalizovanej medicíny je podanie správnej liečby, správnemu pacientovi, v správnej chvíli.

Cielená liečba nádorových ochorení súvisí s pokrokmi v molekulovej patológii, ktoré umožnili poznať signálne cesty nádorového ochorenia a definovať možné ciele pre novú generáciu liekov.

Pri nádoroch bol v poslednom období zaznamenaný pozoruhodný pokrok v oblasti definovania molekulových cieľov, predovšetkým pri mutáciách kľúčových génov (riadiace mutácie – driver mutations) alebo pri amplifikácii týchto génov.

Tieto poznatky viedli v priebehu posledných rokov k zavedeniu niekoľkých nových liekov aj do bežnej klinickej praxe a ich výsledkom je, že sa nádor stáva chronickým ochorením a umožňuje pacientovi prežívanie.

Karcinóm krčka maternice a prsníka ako príklad interaktivity v diagnostike a liečbe onkologického ochorenia

Infekcia vysokorizikovým ľudským papilomavírusom (HPV) a integrácia HPV genómu do hostiteľského chromozómu cervikálnych epiteliálnych buniek sú kľúčovými skorými udalosťami v neoplastickej progresii cervikálnych lézií.

Vírusové onkoproteíny, hlavne E6 a E7 inaktivujú dva hlavné nádorové supresorové proteíny, p53 a pRb. Inaktivácia týchto hostiteľských proteínov narúša mechanizmy opravy DNA, ako aj apoptózu, čo vedie k rýchlej bunkovej proliferácii.

Vírus musí byť schopný integrovať sa do hostiteľskej bunky, aby inicioval infekciu, kde dochádza k sérii genetických udalostí v bazálnych epiteliálnych bunkách, ktoré priamo umožňujú replikáciu vírusu. Tieto udalosti potom vytvárajú prostredie permisívne pre neoplastickú progresiu. V tomto bode sa vírus musí vyhnúť imunitnému systému hostiteľa, aby sa zabezpečila jeho nepretržitá replikácia v bazálnych epiteliálnych bunkách.

Mierna dysplázia epitelu označovaná ako LSIL/CIN 1 je prekancerózne štádium, keď vírus trvalo infikuje bunky krčka maternice. Prechod z prekanceróznej lézie na invazívny karcinóm trvá asi 10 – 12 rokov, ale infekcia sa môže aj spontánne vyhojiť.

Z lézií LSIL/CIN 1, ktoré neregredujú, sa môže v priebehu 2 – 3 rokov po infekcii vyvinúť stav označovaný ako High grade SIL (HSIL), čo je prekancerózny stav blízky nádorovej proliferácii, predtým označovaný ako stredne ťažká dysplázia – CIN 2/3.

K onkogenéze dochádza iba v dôsledku plodných genómových a epigenomických zmien v týchto bunkách. Samotná HPV infekcia nestačí na spustenie rozvoja rakoviny krčka maternice.

Po integrácii začnú vírusové proteíny poškodzovať hostiteľské bunky. Hostiteľské bunky si vyvinuli špeciálny mechanizmus na opravu poškodenia spôsobeného ich DNA prostredníctvom reakcie na poškodenie DNA. Akonáhle je poškodená DNA opravená, môžu byť kontrolné body bunkového cyklu zmiernené a bunky môžu pokračovať v delení.

Poznanie špecifických molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom etiopatogenézy rakoviny krčka maternice, je dôležité pri objavovaní potenciálnych molekulárnych markerov – biomarkerov pre identifikáciu prekanceróznych lézií a včasného štádia rakoviny krčka maternice, čo podporuje včasnú liečbu a poskytne lepšiu prognózu jednotlivcom.

Takýmto biomarkerom je CDKN2A (známejší ako p16). Upregulácia CDKN2A (p16) pri včasnej rakovine je indikátorom odpovede hostiteľa pri deaktivácii pRb a uvoľnení rodiny E2F. Stanovenie p16 v bioptickom materiáli z krčka maternice, ale aj niektorých nádorov, potvrdzuje prekancerózny, resp. nádorový stav, ktorého príčinou je možná infekcia HPV. Ide o HPV indukované nádory anogenitálneho traktu, orofaryngeálne nádory, niektoré nádory pažeráka a močového mechúra, endocervikálny adenokarcinóm a niektoré nádory maternice.

Ďalším biomarkerom pri rakovine krčka maternice je Ki-67, jadrový antigén spojený s proliferáciou buniek. V normálnom krčku maternice je Ki-67 lokalizovaný v bazálnej a suprabazálnej vrstve, zatiaľ čo v dysplastických léziách je exprimovaný vo všetkých epitelových vrstvách, čo znamená zvýšenú (nádorovú) bunkovú proliferáciu. U iných solídnych nádorov je Ki-67 spojený s proliferačnou aktivitou a je prognostickým faktorom možnej odpovede na liečbu.

V posledných rokoch sa zistilo, že pozitivita HPV bola pozitívne korelovaná so zvýšenou expresiou PD-L1. Taktiež sa zistilo, že zvýšená expresia PD-L1 je významným faktorom pri metastázovaní nádoru, progresii nádoru a je spojená so zlou prognózou karcinómu krčka maternice.

Inhibítory PD-1/PD-L1 môžu byť novou voľbou na zlepšenie klinických výsledkov pri liečbe pacientov s rekurentným, pretrvávajúcim alebo metastatickým karcinómom krčka maternice, kde iná liečba zlyháva.

Vyšetrovanie expresie PDL-1 je prediktívne vyšetrenie pre indikáciu imunoterapie, teda liečby pomocou inhibítorov imunitných kontrolných bodov ovplyvňujúcich interakcie medzi molekulami PD-1 a PD-L1. Pred zahájením imunoterapie v 1. línii systémovej liečby je nevyhnutné uskutočniť vyšetrenie expresie proteínu PD-L1 v nádorových bunkách. Vyšetrenie sa robí imunohistochemicky tak v prípade nedlaždicovobunkových, ako aj dlaždicovobunkových karcinómov.

Ďalším príkladom je karcinóm prsníka. Zjednodušene sa dá povedať, že to nie je jedno ochorenie, ale ide o heterogénnu skupinu ochorení, ktoré pomocou molekulárnych, respektíve genetických metód môžeme rozlíšiť na niekoľko odlišných podtypov. Tie sa líšia svojím epidemiologickým pozadím, biologickou povahou, prognózou a rôznou odpoveďou na protinádorovú liečbu.

Po niekoľko desaťročí sa karcinómy prsníka klasifikovali iba podľa histologického typu, prípadne stupňa zrelosti. S rozvojom molekulárnej biológie a lepším poznaním biologickej podstaty karcinómu prsníka sa postupne pridávali ďalšie parametre.

Na podklade podobnosti génovej expresie medzi primárnymi nádormi, nádorovými bunečnými líniami a zdravým tkanivom prsníka sa rozlíšili tieto podtypy:

1. basal-like karcinómy (minimálna alebo žiadna génová expresia ER, zvýšená expresia cytokeratínu 5, 6 a 17, expresia EGFR, často prítomná mutácia p53),
2. HER2 pozitívne karcinómy (zvýšená expresia HER2/neu génu, génu GRB7),
3. luminal-like karcinómy
   a. luminal A,
   b. luminal B,
4. normal breast-like (profil génovej expresie podobný profilu normálneho prsníka).

Keďže v bežnej praxi často nie je možné adekvátne vyšetrenie génovej expresie, z klinického pohľadu sa uplatňuje model a rozdelenie na základe jednoduchšieho imunohistochemického vyšetrenia expresie estrogénového receptora (ER), progesterónového receptora (PgR), HER2 receptora a indexu Ki-67:

• karcinómy ER/PgR pozitívne (luminal A s nízkou hodnotou Ki-67, luminal B s vysokou hodnotou Ki-67),
• HER2 pozitívne (zvýšená expresia HER2),
• a triple-negatívne karcinómy (negativita ER, PgR i HER2).

Najlepšiu prognózu majú pacientky s karcinómami s pozitivitou ER/PgR receptoru (a to najmä pacientky s luminal A).

Historicky boli HER2 pozitívne karcinómy spájané s výrazne horšou prognózou, agresívnym správaním ochorenia, kratším časom do relapsu a kratším celkovým prežívaním. Vďaka možnostiam cielenej liečby zameranej proti HER2 receptoru sa prognóza tejto skupiny pacientok výrazne zlepšila (podľa niektorých prác je porovnateľná ako u ER/PgR pozitívnych karcinómov).

HER2 je receptor, ktorý sa nachádza na povrchu mnohých buniek a zúčastňuje sa ich odpovede na prítomnosť určitých rastových faktorov. V niektorých nádorových bunkách sa nachádza abnormálne vysoké množstvo HER2 receptorov, ktoré môžu vyvolať delenie buniek, ich rýchlejšiu novotvorbu a bujnenie (proliferáciu). Tieto bunky sa nazývajú HER2 pozitívne bunky. Až 30 % žien s rakovinou prsníka je HER2 pozitívnych.

Receptor HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) je súčasťou rodiny štrukturálne podobných receptorov HER, čiže ErbB, ktoré sú exprimované bunkami rozličných tkanív epitelu a uplatňujú sa pri proliferácii a diferenciácii buniek, a tak môžu mať vplyv na vývoj rakoviny prsníka. Gén HER2 produkuje HER2 proteíny, ktoré sú receptormi na povrchu buniek. V zdravom prsníku HER2 proteíny napomáhajú kontrole rastu, delenia a reparácie buniek.

Približne v 25 % nádorov prsníka nepracuje gén HER2 správne a vyrába veľké množstvo kópií (známych ako amplifikácia), čo má za následok zvýšenú tvorbu HER2 receptorov (overexpresia HER2 proteínu). Overexpresiu či amplifikáciu HER2 vykazuje 15 – 20 % karcinómov prsníka. HER2 pozitivita je spojená s nepriaznivou prognózou a so špecifickým patologickým profilom karcinómu prsníka – znížená expresia HR, vyšia proliferačná aktivita (score Ki67) a horší stupeň diferenciácie.

Vyšetrovanie HER2 proteínu sa robí imunohistochemicky (zlatý štandard) alebo pri neistej imunohistochemickej expresii florescenčnou in situ hybridizáciou (FISH). FISH dokazuje množstvo kópií HER2 génu v nádorových bunkách. Výsledky FISH testu môžu byť pozitívne (amplifikácia HER2 génu) alebo negatívne (bez amplifikácie HER2 génu).

A aká je budúcnosť patológie?

Ešte dlhý čas ostane klasické morfologické vyšetrenie zlatým štandardom. Budú však pribúdať ďalšie a ďalšie možnosti, ktoré so sebou molekulárna patológia prináša. Bude to cesta, ktorá určite prinesie aj negatívne výsledky, ale aj tie posunú možnosti diagnostiky a vyhliadky pacienta.

Cirkulujúce a diseminované nádorové bunky
Prítomnosť cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) v periférnej krvi je jedným z nových a sľubných prognostických faktorov u onkologických pacientov. Cirkulujúce nádorové bunky sú bunky zapojené do metastatickej kaskády a nádorového šírenia. Predpokladá sa, že z jedného gramu nádorového tkaniva sa v priebehu 24 hodín uvoľňujú približne 3 milióny nádorových buniek do obehu. Cirkulácia predstavuje nepriaznivé prostredie pre CTC a predpokladá sa, že 99 % CTC uhynie s biologickým polčasom 1 − 2,5 hod. Asi 1 % buniek prežije pobyt v cirkulácii a 0,1 % z nich je schopných vytvoriť metastázy.

Klinické využitie detekcie CTC sa môže uplatniť:

• pri určovaní prognózy, pri monitorovaní efektu liečby,
• ako miniinvazívna biopsia nádoru v reálnom čase umožňujúca individualizáciu liečby,
• pri identifikácii terapeutických cieľov.

Metóda je založená na princípe imunofluorescencie a umožňuje kvantifikáciu CTC. Prognostická hodnota CTC bola opakovane preukázaná pri metastatickom karcinóme prsníka, prostaty a pri kolorektálnom karcinóme.

Cirkulujúca nádorová DNA
Analýza cirkulujúcich nukleových kyselín sa v súčasnosti ukazuje ako najvhodnejší spôsob neinvazívneho DNA skríningu.

Po zavedení metód MPS (multiparalelného sekvenovania) sa postupne preukázalo, že cirkulujúcu nádorovú DNA (ctDNA) možno špecificky detegovať, a to: kvalitatívne (detekcia nádorovo špecifických patogénnych zmien v cirkulujúcej DNA) aj kvantitatívne (množstvo ctDNA koreluje s veľkosťou nádorovej masy) a tiež s vyššou senzitivitou a špecificitou než pri využití cirkulujúcich nádorových buniek.

Rýchle odburávanie ctDNA nastáva po odstránení nádorového tkaniva. Udržanie, respektíve nárast hladiny ctDNA u pacientov je prítomný pri neúspešnom chirurgickom odstránení nádorového tkaniva alebo u pacientov s relapsom ochorenia.

Záver

S rozvojom molekulárnej patológie a s poznaním signálnych dráh vzniku nádorového ochorenia by v dnešnej dobe malo byť vyšetrenie genetických mutácií štandardným vyšetrením v procese diagnostiky. Nie vždy sa však vzorky nádorového tkaniva vyšetrujú aj geneticky, a to najmä z týchto dôvodov:

• nedostatočná vzorka nádorového tkaniva,
• zlý výkonnostný stav pacienta,
• nedostupnosť laboratórneho vyšetrenia,
• príliš dlhý čas do získania výsledku, kvôli ktorému nechce lekár/pacient odďaľovať liečbu,
• vysoký vek pacienta,
• vysoké náklady na liečbu,
• stále zaužívaná predstava, že tieto vyšetrenie sú niečo „nad rámec“ bežnej diagnostickej praxe, alebo že predstavujú akýsi „nadštandard“, a preto by mali byť realizované len v obmedzených prípadoch. Tento pohľad na vec však dnes už neplatí. Ako bolo uvedené vyššie, tieto vyšetrenia sú diagnostickým štandardom a ich rozsah neustále narastá a stávajú sa súčasťou bežnej diagnostickej praxe. Svedčí o tom aj fakt, že výsledky týchto vyšetrení majú zásadný vplyv na vytváranie nových klasifikácií nádorových ochorení. Tvoria základ personalizovanej liečby, ktorá šetrí nielen zdroje z verejného zdravotníctva, ale v konečnom dôsledku aj pacienta.

Literatúra

1. J. Bodnár, M. Kuncová, P. Štefková, Heterogenita nádoru a plasticita nádorových buniek počas progresie malígnych nádorov prsníka, Diagnóza? ,Číslo2, 7-18, (2021)
2. 2H.G. Russnes, O.C. Lingjaerde, A.L. Borresen_Dale, C.Caldas. Breast cancer molecular stratification: from intrinsic subtypes to integrative clusters. Am.J.Pathol.187,2152-2162 (2017)
3. V. Tancoš, J. Bodnár. Snychronny výskyt high-grade skvamóznej intraepiteliálnej lézie krčka maternice a karcinómu endometria. Diagnóza?, číslo 2, 17-21 (2023)